外源褪黑素对盐胁迫下二色补血草种子萌发及幼苗抗盐特性的影响

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我国可耕地面积中25%是盐渍化土壤,总面积约为1×10~8 hm~2。如何利用好这些盐碱地对于解决我国的资源短缺与粮食安全等问题十分重要。二色补血草(Limonium bicolor L.)是一种越年生植物,属于白花丹科,补血草属。二色补血草不仅具有较强的耐盐能力,而且也具有较高的药用价值与观赏价值,在盐碱地拓荒方面有广泛的前景。褪黑素(melatonin,MT)是一种吲哚类小分子物质,生物功能多样。目前研究发现,褪黑素在植物生长发育的许多过程中发挥重要作用,尤其在植物应对生物胁迫与非生物胁迫中。目前关于褪黑素参与植物耐盐性的研究都集中在甜土植物,关于褪黑素对盐生植物在盐胁迫下的影响未见报道。本研究以泌盐盐生植物二色补血草为材料,通过不同浓度外源褪黑素浸种及外源褪黑素浇灌幼苗的方法,探讨褪黑素对盐胁迫下二色补血草种子萌发及幼苗抗盐性的影响,以期阐明褪黑素对二色补血草幼苗耐盐性的影响及其生理机制,为褪黑素提高植物耐盐性提供重要的理论依据。主要研究结果如下:在200 mM NaCl胁迫下,分别用0-500μM褪黑素浸种二色补血草种子24小时后,观察二色补血草种子的发芽率,发芽指数和发芽势。结果表明,外源褪黑素处理明显缓解了NaCl对二色补血草种子萌发的抑制,其中200μM褪黑素处理效果最好,即200μM褪黑素显著提高了200 mM NaCl胁迫下二色补血草种子的发芽率。在种子萌发过程中,赤霉素(GA)的合成与脱落酸(ABA)的分解对种子萌发十分重要。为了进一步研究褪黑素缓解NaCl胁迫下二色补血草种子萌发的可能机理,分别测定了ABA和GA的含量及其相关基因的表达情况,结果表明褪黑素促进了NaCl胁迫下GA合成基因GA20ox和GA3ox的表达,加速GA的合成,提高了GA含量;增强了ABA分解基因CYP707A1和CYP707A2的表达,减弱了ABA合成基因NCED1,NCED3的表达,从而降低了ABA的含量。实验结果还表明褪黑素促进了盐胁迫下二色补血草种子蛋白质的合成,糖代谢,淀粉酶与α淀粉酶的活性。褪黑素通过以上途径减轻了200 mM NaCl对二色补血草种子萌发的抑制,促进了二色补血草种子在200 mM NaCl胁迫下的萌发。用不同浓度的NaCl溶液处理6叶期的二色补血草幼苗,2周后发现二色补血草的生长在300 mM NaCl溶液处理下被明显抑制。外源褪黑素明显缓解了300mM NaCl对二色补血草生长的抑制。进一步研究发现褪黑素通过增加二色补血草的光合作用,降低活性氧(ROS)水平,从而降低了NaCl对二色补血草幼苗生长的抑制,促进了其生长。为进一步弄清外源褪黑素提高二色补血草幼苗耐盐性的生理机制,在6叶期施加300 mM NaCl胁迫与外源褪黑素处理后发现:用5μM褪黑素处理的二色补血草在300 mM NaCl胁迫下的生物量显著提高,同时减缓了二色补血草叶片中叶绿素的降解,提高了300 mM NaCl胁迫下二色补血草的蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、净光合速率(Pn),胞间二氧化碳浓度(Ci),从而缓解了高盐胁迫对二色补血草光合作用的抑制。盐胁迫会导致植物体内产生渗透胁迫与离子胁迫。对二色补血草施加外源褪黑素后,发现褪黑素提高了二色补血草中可溶性糖,可溶性蛋白,脯氨酸与有机酸的含量,维持了细胞中的水分平衡。植物在遭受到离子胁迫后,体内会产生大量的活性氧物质,从而导致氧化胁迫。外源褪黑素通过提高抗氧化酶APX、SOD、CAT、POD的活性降低了H2O2和O2-以及MDA含量,降低了活性氧(ROS)水平,提高了植物的抗氧化能力。盐胁迫引起植物体内的ROS水平升高,H2O2作为植物应激反应的重要信号分子,可作为第二信使激活下游Mitogen-activated protein kinases(MAPK)级联反应,引起抗氧化相关的转录因子的表达上调,从而提高植物在盐胁迫下的耐受能力。对二色补血草施加外源褪黑素后,MAPK基因表达量上调,且上调了ZAT、NAC、WRKY、DRE、BMYB和CBF等转录因子基因的表达,提高了二色补血草的耐盐性。盐胁迫提高了二色补血草中的离子含量,造成离子毒害。外源褪黑素处理明显增加了300 mM NaCl胁迫下二色补血草叶片盐腺的泌盐能力,降低了叶片中Na+与Cl-的含量,增加了K+含量上升,提高了K+/Na+比。荧光显微镜检测发现,外源褪黑素促进了二色补血草幼苗叶片盐腺数目的增加与盐腺半径的扩大,从而增强了300 mM NaCl胁迫下二色补血草的泌盐能力,最终增强了二色补血草对盐胁迫的耐受能力。有研究表明,盐腺的泌盐过程是以细胞质膜上的H+-ATPase建立起跨膜的H+电化学势梯度作为驱动力,利用质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS)排出Na+。且高亲和性钾转运蛋白(HKT)与液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)在维持细胞内离子稳态过程中发挥重要作用。利用褪黑素处理二色补血草幼苗后,通过荧光定量PCR(q PCR)发现基因NHX1、SOS1、HKT1以及H+-ATPase基因(PMA)的表达量明显升高。囊泡相关膜蛋白VAMPs(vesicle-associated membrane protein)在泌盐过程中同样发挥重要作用。对褪黑素处理后的二色补血草囊泡运输膜蛋白VAMPs三个相关基因LB00297、LB11044和LB11277进行q PCR后发现,其表达量同样升高。表明,褪黑素通过促进NHX1、SOS1、HKT1、PMA等基因以及泡运输膜蛋白VAMPs三个相关基因LB00297、LB11044和LB11277的表达,促进二色补血草盐腺泌盐,维持细胞间的离子平衡,增强二色补血草对盐胁迫的耐受性。总之:外源褪黑素通过增加300 mM NaCl胁迫下二色补血草泌盐相关基因的表达,从而增强盐腺的泌盐能力,同时有机渗透调解物质的积累,增强其抗氧化能力以及光合作用,降低盐胁迫下二色补血草的离子毒害与活性氧含量,最终通过促进二色补血草的生长与发育,提高二色补血草的抗盐性。
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