阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)由于存在慢性间歇性缺氧而诱发机体发生氧化应激状态的改变,而氧化应激可导致机体多系统多器官发生病变,因而OSAHS近年来受到了越来越多学者的关注。已有研究显示缺氧与肿瘤密切相关,但关于OSAHS慢性间歇性缺氧所致氧化应激与恶性肿瘤的相关性研究目前报导极少。本研究通过监测OSAHS患者的氧化应激状态,探讨AOPP的测定意义；并模拟OSAHS这种特殊的缺氧模式,建立慢性间歇性缺氧的细胞模型和动物模型,观察慢性间歇性缺氧条件下结肠癌SW480细胞和结肠癌移植瘤宿主的氧化应激状态,探讨氧化应激水平的改变对恶性肿瘤生长增殖的影响。本研究分为三个部分：一、OSAHS患者的氧化应激状态及AOPP的测定意义；二、间歇性缺氧时结肠癌细胞的晚期氧化蛋白产物的表达及其与血管内皮生长因子、转化生长因子β1的关系；三、结肠癌SW480细胞移植瘤宿主在慢性间歇性缺氧条件下晚期氧化蛋白产物的表达及与机体氧化应激水平的相关性；探讨相应氧化应激状态的改变对肿瘤生长增殖的影响。一、OSAHS患者氧化应激状态及其相关影响因素1.1研究目的通过检测OSAHS患者晚期氧化蛋白产物(AOPP)和其它氧化应激因子的表达,探讨AOPP在反映OSAHS氧化应激水平的价值及在OSAHS病情演变中的临床意义。1.2研究方法检测47例OSAHS患者和48例健康对照组血浆中AOPP、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的水平并进行比较。结果应用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料以(x±s)表示,组间的比较采用单因素方差分析,相关分析采用correlate- bivariate- pearson检验,P<0.05为差异有统计学意义。1.3研究结果1.3.1 OSAHS患者AOPP及其它氧化应激相关因子的表达与健康对照组相比,OSAHS的血浆AOPP、MDA明显升高,P<0.01,血浆SOD、GSH-PX显著降低P<0.01。OSAHS患者按病情轻重分为轻、中、重三组,其各组间血浆AOPP、MDA、SOD、GSH-PX的差异均具有统计学意义(P值均<0.01),其中AOPP、MDA随着病情的加重而明显升高,GSH-PX、SOD随着缺氧的加重而显著降低。1.3.2 OSAHS患者其AOPP水平与其他氧化应激因子的相关性OSAHS患者AOPP水平与SOD (r=-0.695),与GSH-PX(r=-0.367),与MDA (r=0.823)均有相关性(P均<0.01),其中与MDA水平呈正相关,与SOD、GSH-PX水平负相关；且其中相关系数的绝对值以MDA最大,提示AOPP与MDA的相关性最好,而与GSH-PX的相关性最小,其Pearson相关系数为一0.367,绝对值<0.5。1.3.3 OSAHS患者AOPP等氧化应激因子与各睡眠监测指标的相关性分析OSAHS患者AOPP、MDA、SOD、GSH-PX水平与AHI、T90%、LSaO2均具相关性,其中AOPP、MDA水平与AHI、T90%呈正相关,与LSaO2负相关,(P均<0.01); SOD、GSH-PX水平与AHI、T90%呈负相关,与LSaO2为正相关(P均<0.01)。其中AOPP与反映OSAHS病情轻重的指标AHI的相关性好(r=0.826,>0.5,P值<0.01)。1.4研究结论OSAHS患者随着病情的加重体内氧化应激程度加重、蛋白氧化损伤程度增强,AOPP是反映OSAHS蛋白氧化损伤的早期敏感指标。二、间歇性缺氧时结肠癌细胞的晚期氧化蛋白产物的表达及其与血管内皮生长因子、转化生长因子β1的关系2.1研究目的测定间歇性缺氧时结肠癌SW480细胞晚期氧化蛋白产物(AOPP)和其他氧化应激指标的水平,以及与血管内皮生长因子(VEGF),转化生长因子β1(TGF-β1)的表达,探讨结肠癌细胞在间歇性缺氧时其蛋白氧化损伤与氧化应激状态的关系,及与血管生成因子的相关关系。2.2研究方法建立细胞缺氧模型,SW480细胞按缺氧条件的不同分为：间歇性缺氧组(A组)、持续性缺氧组(B组)、常氧对照组(C组)。采用ELISA法检测AOPP和VEGF,黄嘌呤羟胺法测定超氧化物岐化酶(SOD),分光光度法测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),用免疫荧光染色方法及Western blot方法测定TGF-β1的表达。结果应用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以(x±s)表示,组间的比较采用单因素方差分析,相关分析采用correlate- bivariate- pearson检验,P<0.05为差异有统计学意义。2.3研究结果2.3.1不同缺氧条件下AOPP与其它氧化应激因子的表达与对照组C组比较,A组和B组的AOPP、MDA均升高(P均<0.05)；SOD、GSH-PX下降(P均<0.05)。A组与B组比较时两者的差异也具有统计学意义(P均<0.05),间歇性缺氧较持续缺氧时AOPP、MDA明显升高,SOD、GAH-PX显著下降(P均<0.05)。2.3.2 AOPP与其它氧化应激因子的相关性对间歇性缺氧组的AOPP水平与其他各项氧化应激指标进行相关性分析时发现：AOPP与MDA (r=0.803)呈正相关,与SOD (r=-0.877)为负相关,P值均<0.01。AOPP与GSH-PX (r=0.413)为负相关,P值均>0.05,无明显相关关系。AOPP与常用的氧化应激因子存在相关性,AOPP可反映机体氧化应激的程度。2.3.3AOPP与血管生成因子的相关性AOPP与血管生成因子：AOPP与VEGF(r=0.868),与TGF-β1(r=0.745),P值均<0.01,为正相关关系。2.4研究结论间歇性缺氧时SW480细胞的蛋白氧化损伤增强,较持续缺氧时明显,并且与氧化应激的程度相关。缺氧时血管生成因子VEGF和TGF-β1较常氧条件下表达上调,且以间歇性缺氧时显著,VEGF和TGF-β1的表达与AOPP相关。三、慢性间歇性缺氧时机体的氧化应激状态及对结肠癌增殖的影响3.1研究目的研究慢性间歇性缺氧(CH)时结肠癌SW480移植瘤宿主晚期氧化蛋白产物(AOPP)的表达及与其他氧化应激指标的关系,观察CH条件下肿瘤的生长特点、血管密度的变化及相应的血管内皮生长因子(VEGF),转化生长因子D1(TGFβ1)的表达,探讨CH所致氧化应激对结肠癌生长增殖的影响。3.2研究方法建立慢性间歇性缺氧的动物模型,分为四组：A组：常氧无瘤组(空气,5%CO2),B组：常氧荷瘤组,C组：缺氧无瘤组(5%O2,90%N2,5%CO2), D组：缺氧荷瘤组。测定慢性间歇性缺氧条件下人结肠癌SW480细胞的氧化应激状态；机体缺氧后结肠癌SW480细胞移植瘤的生长曲线、移植瘤中微血管密度变化；缺氧后机体的氧化应激水平,血清和移植瘤VEGF、TGFβ1的表达。结果应用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以(x±s)表示,组间的比较采用单因素方差分析,相关分析采用correlate- bivariate- pearson检验,P<0.05为差异有统计学意义。3.3研究结果3.3.1 B、D两组移植瘤的生长曲线(体积、重量)B、D两组裸鼠的成活率以及肿瘤的成瘤率均为100%,两组移植瘤的体积在7d及30d时均无显著差异,P均>0.05；在14d及21d时常氧B组的肿瘤体积甚至比缺氧D组大,P均<0.01；但两组肿瘤的重量存在显著性差异,D组肿瘤明显重于B组,P<0.01。3.3.2四组裸鼠血清AOPP和8-OHdG水平测定A组为常氧条件下饲养未进行肿瘤接种的对照组,B组与A组比较发现B组的AOPP、8-OhdG和NO升高, SOD值下降,但无统计学差异,P>0.05。C组和D组分别与A组比较时,C、D组AOPP、8-OhdG和NO较A组升高,SOD值下降,差异具统计学意义,P<0.05。当D组与C组进行两两比较时,D组的AOPP、8-OhdG和NO较C组高,SOD较C组低,差异均具有显著性,P<0.05。3.3.3 RT-PCR法测定人结肠癌SW480细胞移植瘤iNOS的表达对iNOS mRNA进行逆转录和30个PCR循环,其产物大小为478bp,内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在同样条件下,其产物为180bp,与B组(常氧荷瘤组)比较,D组(缺氧荷瘤组)iNOS mRNA表达明显升高,具有统计学意义。3.3.4 移植瘤微血管密度变化慢性间歇性缺氧组(D组)其结肠癌组织中血管密度(MVD)值为(62.89-4-1.341),而常氧组中结肠癌的MVD表达水平为(48.06-0.900),二者存在显著性差异(P<0.01),表明慢性间歇性缺氧促进结肠癌血管的形成。3.3.5四组小鼠血清中的VEGF水平及B、D两组肿瘤组织中的VEGF表达四组小鼠血清中的VEGF比较：B组与A组比较时发现B组数值(1.923±0.231)虽较A组(1.865±0.307)高,但无统计学差异,P>0.05。C组(3.182+0.743)、D组(3.529±0.847)均较A组升高,差异具统计学意义,P<0.01。当D组与C组进行比较时,差异也具有显著性,P<0.01。两组肿瘤组织中的VEGF表达：D组(42.326±9.512)较C组(50.921±11.633)明显升高,差异具统计学意义,P<0.01。3.3.6 Western blok法测定人结肠癌SW480细胞移植瘤TGF-β1的表达常氧条件下结肠癌移植瘤组织有TGF-β1的表达,在慢性间歇性缺氧时结肠癌移植瘤组织的TGF-β1表达明显升高。3.4研究结论慢性间歇性缺氧时移植瘤宿主内蛋白氧化损伤增强,AOPP升高,并且与机体的氧化应激程度有关。慢性间歇性缺氧条件下肿瘤组织的血管密度分布增高,同时,血管生成因子VEGF和TGF-β1的表达上调,并且与氧化应激水平正相关,提示慢性间歇性缺氧所致氧化应激促进肿瘤的生长与增殖。小结1、OSAHS患者AOPP水平升高,与机体氧化应激损伤程度正相关。2、OSAHS患者AOPP水平与病情分度呈正相关；机体的抗氧化能力与OSAHS患者病情分度呈负相关。3、间歇性缺氧时SW480细胞的蛋白氧化损伤增强,较持续缺氧组明显；且与氧化应激状态有关。4、间歇性缺氧时SW480细胞的血管生成因子VEGF和TGF-β1均表达,以间歇性缺氧时显著,二者的表达均与AOPP相关。5、慢性间歇性缺氧时肿瘤体积较常氧条件下略小,但肿瘤组织较致密,其重量较常氧时增大。6、慢性间歇性缺氧时移植瘤宿主内其蛋白氧化损伤增强,AOPP升高；与氧化应激状态有关。7、慢性间歇性缺氧时血管生成因子VEGF和TGF-β1表达明显高于常氧组。8、慢性间歇性缺氧条件下肿瘤血管密度较常氧条件下增大,与VEGF和TGF-β1表达水平正相关。9、慢性间歇性缺氧时移植瘤宿主的AOPP表达与血管生成因子VEGF和TGF-β1相关。创新点本研究通过观察OSAHS患者的缺氧模式与氧化应激状态的关系,模拟OSAHS的特殊缺氧模式建立了慢性间歇性缺氧的细胞模型及动物模型,深入研究人结肠癌SW480细胞在细胞局部及整个机体发生间歇性缺氧时其对应的氧化应激状态和蛋白氧化损伤情况,移植瘤的生长变化,瘤体内血管密度的改变,以及血管生长因子VEGF和TGF-β1的表达；探讨间歇性缺氧对结肠癌增殖的影响。有关慢性间歇性缺氧所致氧化应激对结肠癌预后的影响,目前国内外尚无报道,此研究的完成,将对阐明结肠癌生长增殖的相关机制作出重要补充,为指导临床改善结肠癌患者的预后提供理论基础,为结肠癌患者的防治拓展新思路。