水稻是重要的粮食作物,提高其抗逆性,对于高产、稳产至关重要。而水稻作为喜温作物,低温胁迫便是阻碍其高产稳产的一大因素。因此利用全基因组关联分析挖掘耐冷基因,鉴定耐冷种质资源,运用转基因方法鉴定耐冷基因并研究参与冷胁迫的分子机制对培育水稻抗逆品种极其重要。本文分成两大部分来解析鉴定耐冷品种、关联分析挖掘耐冷基因、利用分子生物学的方法研究耐冷基因的分子机制,主要结果如下:1本研究利用582份水稻资源进行了全基因组关联分析,鉴定出耐冷品种和冷敏感品种,并挖掘了候选耐冷基因:1.1.根据表型数据统计结果,将572份种质资源分成三个等级,属于高度耐冷、中度耐冷和冷敏感的种质资源分别有23份、64份和61份。1.2.在粳稻种质资源群体中定位到两个耐冷候选基因,分别是细胞色素P450相关基因LOCOs01g50490和抗逆相关基因LOCOs06g36240。1.3.在籼稻群体中总共定位到59个耐冷候选基因,36个集中在11号染色体上,其中17个是与水稻抗病性相关的基因。其中有4个已克隆的与水稻的非生物胁迫相关的重要耐冷候选基因,如MYB家族基因LOCOs11g47460参与内源新激素和非生物胁迫;与冷相关的基因LOCOs11g47500和LOCOs11g47820;过表达植株对生物和非生物胁迫表现出抗性基因LOCOs03g29760。另有2个耐冷候选基因LOCOs11g47760 和 LOCOs09g20090 与其他抗逆相关。1.4.在种质资源的整个群体中,共定位149个候选基因。其中定位到一个非常重要的已克隆耐冷基因LOCOs12g40550,它参与ABA非依赖型的耐冷信号传导,是调节低温胁迫中酰脲降解的一个至关重要的低温响应基因,此类耐冷基因被定位到也证明此次研究是有效可靠的。另定位到有3个与冷相关的重要耐冷候选基因,LOCOs08g4053启动子中有与抗旱、耐冷、ABA信号传导有关的顺式元件;LOCOs04g37619,参与ABA合成途径,被花药低温诱导,在冷敏感耐冷水稻中差异表达;温度相关的基因LOCOs12g40540在常温上调,高温下调。另有5个基因候选基因 LOCOs02g08230、LOCOs02g12580、LOCOs02g12800、LOCOs04g37630 和 LOCOs1lg34440 与其他抗逆相关。2.本文选择冷相关基因OsCTE3,通过对其转基因材料的表型鉴定、激素处理、酵母双杂交和体外泛素化实验来综合分析OsCTE3参与冷胁迫的分子机制:2.1.表型鉴定结果显示,OsCTE3能被冷胁迫诱导表达,表达量在冷处理48hr小时内上调明显,其过表达转基因植株呈现冷敏感,干扰植株呈现耐冷的表型,且耐冷或冷敏感的表型跟转基因植株内OsCTE3的表达量相关,OsCTE3的表达量越多越冷敏感,越少越耐冷。2.2.激素鉴定实验显示,OsCTE3干扰转基因植株对ABA不敏感,被外源ABA处理后,干扰型植株的茎长和根长都与野生型呈极显著性差异,荧光定量结果显示,在不同浓度的外源ABA处理下,OsCTE3表达量也随之变化。2.3.OsCTE3能被ABA和冷胁迫同时诱导,推测OsCTE3可能参与ABA依赖性信号通路的冷应激反应。2.4.酵母双杂交实验筛选到 OsRNS4、OsDi19-5、Os03g0681400、OsRBCs5、Os03g0784800、Os05g0187000等6个候选基因,酵母内蛋白互作验证中证明它们和目的基因在酵母菌株中表达的蛋白相互作用。OsCTE3可能通过ABA信号传导和26S蛋白酶体途径来协同调控OsRBCs和OsRNS4等蛋白的合成和降解,从而参与冷应激反应。2.5.体外泛素化实验证明OsCTE3是一个具有泛素化活性的E3泛素连接酶。