一、研究背景脑血管病是严重危害人类健康的三大致死疾病之一,具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点,给家庭和社会带来了极大的负担。在脑血管疾病中,缺血性脑血管病占了80%左右。然而,迄今为止只有重组组织血纤维蛋白溶酶原激活物(rt-PA)一种药物获得了FDA的批准用于急性脑缺血的治疗。但rt-PA介入溶栓治疗有严格的时间限制(必须在卒中发生6小时内应用),而且大剂量使用rt-PA也增加了发生脑出血的危险性。因此,如何促进脑缺血后有效的组织和功能修复是当前研究的热点,但也是难点,而干细胞移植是近年来兴起的具有良好的临床应用前途的治疗脑缺血的新方法之一。BMSCs是源于骨髓的一种多潜能成体干细胞,其应用于细胞治疗的主要优势在于其可以自体移植,因而不存在胚胎干细胞移植所存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制。而且骨髓源成体干细胞取材相对简单,不像神经干细胞主要位于脑室下带、海马等脑深部结构中,损伤风险性大、获得困难、细胞来源有限。BMSCs移植治疗已经应用于脑缺血动物实验及临床试验性治疗。BMSCs移植治疗脑缺血的方法较多,包括通过静脉途径、动脉途径或脑内局部注射移植,用于BMSCs治疗大鼠大脑中动脉阻断模型(MCAO),结果发现移植的细胞能定向向缺血灶周围迁徙,参与损伤修复,并促进神经功能的恢复。由于BMSCs具有分化成神经细胞的能力,利用移植的BMSCs发挥细胞替代作用重建神经环路是最直接的治疗方法。然而,大部分的研究发现移植的BMSCs只有相当少的一部分表达神经元或神经胶质细胞的表面标志,而即使这些少量的表达神经组织标志的细胞,目前也没有电生理的或其他方面的证据显示它们具有神经细胞的功能,更无法确定它们是否同其他的神经细胞建立了联系。目前的研究显示,BMSCs的起效机制是多方面的,如：减少缺血半影区细胞凋亡、促进内源性神经干细胞的增殖、促进缺血区新血管再生、抑制胶质瘢痕增生以及促进轴突再生等。归结起来,BMSCs治疗脑缺血的机制主要的并不是其替代了缺失的神经元,而是其在脑内缺血的微环境的刺激下,发挥了“分子工厂”的作用,分泌各种营养因子,介导了以上的治疗作用。BMSCs在骨髓中的数量稀少,因此在应用于细胞移植治疗时必须进行体外扩增以获得足够多的细胞。然而,BMSCs同大多数的成体细胞一样,会发生衰老,主要表现在两个方面：①随年龄增长,BMSCs的数量和质量均有明显下降,而老年人正是脑缺血的高发人群,是可能的需要细胞移植治疗的主体；②BMSCs在体外传代过程中,细胞形态会逐渐发生变化,由细梭形变成宽扁平状,细胞的增殖能力、分化潜力、乃至向病灶区归巢的能力均会逐渐丧失。因此,如果没有采取特殊的处理方法对BMSCs进行改造,只是在体外充分扩增BMSCs再回输回病人体内,实际上已经大大缩短了BMSCs的寿命,也严重影响了治疗的效果。既往对BMSCs发生衰老的机制研究表明,BMSCs不表达端粒酶是一个很重要的原因。因此为了延长BMSC的寿命甚至使之永生化,近几年来,有多家实验室采用的是hTERT基因转染的方法,并成功获得BMSCs永生细胞系。此法建立的细胞系在体外长期培养扩增中端粒长度没有明显缩短,保持了同原代BMSCs相似甚至更好的增殖及多向分化潜能。更为重要的是,用hTERT转染建立的BMSCs细胞系在体外长期培养后仍保持了正常的染色体组型,细胞的生长存在接触抑制,体内、体外实验均没有明显的致瘤性。这是我们选择hTERT作为修饰改造BMSCs的基因之一的原因。此外,通过神经干细胞移植或神经营养因子来促进受损的神经网络的修复是脑缺血治疗的有效策略,但我们注意到,在缺血缺氧的微环境中,干细胞的成活十分困难,增殖和分化能力明显减弱,难于发挥治疗作用。血供的恢复是神经修复的基础,而VEGF是已知的胚胎发育期血管发生及成体后血管再生的最关键因子,VEGF对于脑缺血的治疗作用已有较多文献报道,因此我们又选定了VEGF作为改造BMSCs的另一个基因。既往对于老年的BMSCs的研究较少,对其进行双基因改造的研究更是乏见,近年有研究表明,VEGF和hTERT两者之间有难得的协同增强效应,这也是对我们这一探索性研究意义的一个侧面的肯定。二.研究目的骨髓基质细胞(BMSCs)移植是治疗脑缺血的一个有效策略,然而,BMSCs随年龄增长以及在体外扩增过程中会发生衰老,这阻碍了它的治疗应用。本研究拟以人端粒酶催化亚单位(hTERT)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)慢病毒表达载体双基因联合修饰老年人的BMSCs,探索构建强化表达VEGF的永生化BMSCs系,检测其生物学特征,并以改造后的BMSCs治疗大鼠脑缺血／再灌注模型,检测治疗效果,探讨治疗机制。在实验过程中,与未经修饰的BMSCs及hTERT或VEGF单基因修饰的BMSCs进行对比研究。由于BMSCs含有自体的遗传信息,研究成果将有助于探索制备个体化的(patient-specific)、针对脑缺血治疗的(disease-specific)干细胞产品,也会为进一步的实验研究打下坚实的基础。三.材料和方法1、老年人骨髓基质细胞hBMSC的分离、培养与鉴定：采用本实验室已建立的全血细胞贴壁培养的方法,取正常成年人骨髓,年龄在50岁以上,1：1-1：2加入含有20%FBS血清的DMEM low glucose培养基(含1%双抗),48小时后半量换液,小心去除上层悬浮红细胞,勿晃动下层贴壁细胞,随后继续培养。72小时候再次半量换液,并于倒置显微镜下观察,可见贴壁细胞,随后3～4天正常全量换液,去除多余的不贴壁细胞,一般15天左右可长满,为原代hBMSCs。随后用0.05%的胰酶消化,1：2传代,多次传代后去除可能的成纤维细胞。2、实验分组：将实验细胞分为以下5组：①未转染组(hBMSC);②空病毒组(vehicle)③VEGF转染组(hBMSC-VEGF),应用慢病毒载体携带VEGF165基因以最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)=5体外转染hBMSCs;④TERT转染组(hBMSC-TERT):应用慢病毒载体携带hTERT基因以感染复数MOI=5体外转染hBMSCs;⑤双病毒转染组(hBMSC-V&T):慢病毒载体携带VEGF和hTERT依次以感染复数MOI=5体外转染hBMSCs.3、细胞表型特征：流式细胞仪检测各组细胞表面标志。4、体外管状结构形成：检测细胞接种在Matrigel Matrix(基底膜基质)上,观察细胞形成毛细胞血管状结构的能力。5、裸鼠体内成血管能力测试：将各组细胞移植入裸鼠皮下三周后检测其在裸鼠体内形成血管的能力。6、移植细胞治疗短暂脑缺血模型(tMCAO)大鼠,对其有效性做行为学、组织学、细胞学以及蛋白学等多水平的观察检测,并试图揭示其可能的机制。7、对细胞移植的模型鼠行CatWalk行为学综合评价,以期找到最适合的指标,并评价治疗的效果。8、取移植细胞的模型大鼠脑组织,研究移植细胞在体内的转归及其对缺血大脑分泌细胞因子的影响。9、所有原始数据用均数±标准误(X±SE)表示,采用SPSS13.0统计软件处理。造模后各组大鼠各时间点的数据比较用重复测量的方差分析,单个时间点间数据比较用one-way ANOVA分析,组间的多重比较采用LSD检验法,如果数据方差不齐,则采用welch法进行多组均数的比较,组间多重比较采用Tamhane’s T2法；以P<0.05为差异有统计学意义。四.结果1、本课题组前期实验已验证慢病毒对细胞的转染是成功有效的,细胞的寿命得到显著延长,细胞对端粒酶和VEGF的表达显著增加,并没有明显的致瘤性。2、在前期实验结果的基础上,我们进一步的实验表明,VEGF和hTERT的转染能显著增强hBMSCs的体外成血管能力。3、免疫荧光结果显示Dil标记的移植细胞增加了裸鼠体内表达vWF的血管状结构的形成,并整合进了这种新生的血管样结构。统计结果显示,VEGF或和TERT的转染能显著提高hBMSC移植后在裸鼠体内形成血管样结构的密度和周长。4、大鼠移植hBMSC后,神经功能评分皆有好转,移植组与对照组的差异早期并不是非常显著,但到第7天开始在hBMSC-V (6.5±0.18)和hBMSC-V&T(6.9±0.24)组与对照组(7.6±0.26)见可见显著性差异,并在随后的14天和28天两个时间点移植细胞干预的三组与对照组均出现了显著性的差异。5、TTC染色结果表明,hBMSC的移植对大鼠的梗死区域有减小作用,而其中hBMSC-V&T和hBMSC-V组的效果最明显。6、对大鼠缺血损伤侧的左前肢压强结果分析,各组大鼠28天的左前肢压强有一定程度的恢复,但是在各组间比较,移植hBMSC-V, hBMSC-T和hBMSC-V&T细胞的三组大鼠左前肢压强恢复更显著,与对照组比较有显著性差异,并且V&T组恢复的程度最大。7、对各组大鼠缺血28天后大鼠的四肢最大接触面积结果分析,移植BMSC-V, hBMSC-T和hBMSC-V&T细胞的三组大鼠四肢最大接触面积较仅移植hBMSC的对照组有显著增大。8、模型组大鼠运动速度在造模后第1、3、7、14、28天均比对照组明显减慢,差异均有统计学意义(P<0.05),而步调改变为一过性,模型组大鼠造模后第1、3、7天与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),第14、28天与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。9、MRI成像结果基本同TTC染色结果较一致,各组间存在差异,28天时hBMSC-V&T组的脑梗死灶最小,恢复的程度最大,为153.5±8.45mm3, hBMSC-V组为174.6±6.80mm3, hBMSC-T组为183.1±10.17mm3,而hBMSC对照组为242.3±9.85mm3。10、模型鼠脑组织切片显示移植细胞主要分布在缺血半影区,沿缺血灶周边分布,观察终点时仍有较强的荧光表达。11、基因检测结果表明,模型鼠脑组织的VEGF(人和大鼠)、hTERT(人)、突触素P38表达均增加,CD31染色表明细胞整合进新生的血管,且较对照组血管数目和密度都有增加。五.结论1、hTERT基因慢病毒载体和VEGF基因慢病毒载体联合修饰老年人BMSCs,建立强化表达VEGF的BMSCs细胞系是可行的,安全有效的,具有重要的临床价值。2、大鼠短暂脑缺血模型验证联合修饰的细胞对大鼠的治疗效果显著,神经功能恢复较对照组有明显改善。3、强化表达VEGF的BMSCs细胞治疗缺血性脑卒中的机制可能是增加了大鼠损伤灶周围神经营养因子的分泌,并促进了局部新生血管的形成。