论文部分内容阅读
研究目的阿尔芡海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病,虽然AD的病因多样、复杂,但组织病理学特点却几乎完全一致,即:(1)神经细胞外形成以Aβ淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)沉淀为特征的老年斑(senileplaque,SP);(2)神经细胞内形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT);(3)神经细胞及轴突数量减少。Aβ形成淀粉样沉淀,被认为是导致AD的直接病理原因。最近诸多研究提示,炎症反应在AD的病因和病理过程中具有重要作用,并在Aβ-淀粉样沉淀中发现了被激活的小胶质细胞和炎症分子;同时抗炎症药物能够减缓AD发病的过程。另外,有学者观察到抗炎症药物能够降低类风湿关节炎患者AD的发病率。因此,目前认为激活的小胶质细胞及炎症反应与AD的发病密切相关。探讨AD发病中脑内炎症反应及小胶质细胞的作用,将为AD的药物治疗及研发提供新的思路。本研究是在前期研究的基础上观察AD模型大鼠脑内炎症细胞因子白细胞介素(interleukins,ILs)如IL-1β、IL-6,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors,TNFs)如TNF-α的表达、小胶质细胞的增殖和活性的改变及加味当归芍药散(JWDSS)对其影响,探讨该方对抗AD的作用机制,为其临床应用提供理论依据。研究方法1、大脑海马定位注射聚集态Aβ1-42诱导AD大鼠模型采用海马定位注射Aβ1-42诱导AD大鼠模型,分别观察实验周期为1周和3周的模型大鼠的学习记忆能力的变化,选定造成大鼠学习记忆能力下降的3周为适合的实验周期。2、加味当归芍药散(JWDSS)对AD模型脑内炎症细胞因子表达的影响本研究选用雌性12周龄、体重280±20g SD大鼠66只,随机分为6组:正常对照组,生理盐水对照组。AD模型组,JWDSS高、低剂量组,西乐葆阳性对照组,造模后第三天灌胃给药,JWDSS高、低剂量组分别给予5、2.5倍临床等效剂量的中药浓缩煎液,西乐葆组予5倍临床等效剂量的西乐葆溶液,生理盐水对照组和正常对照组分别予等体积的蒸馏水灌胃,每日1次;连续灌胃21d。给药第20d及21d以跳台法分别检测各组大鼠学习记忆能力。实验结束后各组大鼠经灌注固定后断头取脑并分离海马,连续切片,用HE染色及刚果红染色观察组织病理变化,同时进行细胞因子表达的免疫组化检测。实验结果1、各组大鼠学习记忆能力的检测AD模型组大鼠经过电击躲避训练后,其第1次跳下平台的时间(潜伏期)及3分钟内从平台跳至铜栅上受电击的次数(错误次数)较正常对照组和生理盐水对照组大鼠明显增加(均为P＜0.01),提示AD模型组学习能力较正常对照组和生理盐水组明显下降。生理盐水组大鼠海马注射生理盐水后学习能力与正常对照组比较无显著性差别(P＞0.05)。JWDSS低剂量组、西乐葆对照组的潜伏期较AD模型组下降(分别为P＜0.01,P＜0.05);JWDSS高剂量组、西乐葆对照组的错误次数则较AD模型组下降(分别为P＜0.01,P＜0.05)。24小时后重作测验,AD模型组大鼠跳下平台的潜伏期及受电击的错误次数均较正常对照组和生理盐水对照组明显增加(均为P＜0.01),提示AD模型组记忆能力较正常对照组和生理盐水对照组明显下降。生理盐水对照组大鼠海马注射生理盐水后记忆能力与正常对照组比较无显著性差别(P＞0.05)。JWDSS低剂量组、西乐葆对照组的潜伏期较AD模型组下降(均为P＜0.05);JWDSS高剂量组、西乐葆对照组的错误次数则较AD模型组下降(分别为P＜0.01,P＜0.05)。2、各组大鼠海马组织切片HE染色结果模型组可见注射针道附近细胞增生、聚集,核小深染,呈扁圆形或三角形,胞质少,判断为小胶质细胞,锥体细胞带不完整,神经元丧失。正常对照组细胞带完整,胶质细胞呈散在分布,生理盐水对照组针道附近少量胶质细胞增生,受损细胞带明显较窄;与模型组相比,西乐葆组、JWDSS高、低剂量组小胶质细胞反应性增生及神经元丧失情况明显减轻,但仍较生理盐水组严重。3、各组大鼠海马组织切片刚果红染色结果模型组刚果红染色见棕红色淀粉样蛋白聚集在注射区并向周围扩散,苏术素复染示Aβ1-42聚集区为大量增生的胶质细胞,与AD中的老年斑构成相似;正常对照组和生理盐水对照组刚果红染色浅淡,少量胶质细胞增生,受损细胞带明显较窄;与模型组相比,西乐葆组、JWDSS高、低剂量组刚果红染色变浅,胶质细胞反应性增生及神经元丧失情况明显减轻,但仍较生理盐水组严重。4、各组大鼠海马组织炎症因子免疫组化检测结果海马组织的免疫组化检测显示,AD模型组海马组织细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达均增强,表明海马一次性定位注射聚集态Aβ1-42可诱导炎症细胞因子的表达增强,产生炎症反应,中药组及西乐葆组IL-1β、IL-6、TNF-α表达均较模型组明显降低,提示中药组及西乐葆组通过抑制炎症细胞因子的表达而减轻Aβ1-42诱导的脑组织炎症反应,从而对抗AD。5、各组大鼠海马组织p-tau免疫组化检测结果p-tau免疫组化检测示,AD模型组海马组织细胞p-tau表达增强,中药组及西乐葆组p-tau表达较模型组明显降低,提示JWDSS和西乐葆对抗AD模型组p-tau蛋白的过表达,减少p-tau的产生,这将减少神经细胞内神经原纤维缠结的形成,从而对抗AD。结论1.采用海马一次性定位注射聚集态Aβ1-42复制AD的大鼠动物模型,时间为3周是较为适合的实验周期。该模型可模拟AD的行为学改变,学习记忆能力下降。2.海马一次性定位注射聚集态Aβ1-42可激活脑内小胶质细胞和星型胶质细胞,致炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α等表达增加及p-tau过表达,模拟了AD脑内的炎症反应和AD脑内的主要病理生理变化之一即tau蛋白的过磷酸化,并可使模型动物出现AD行为学的改变,学习、记忆能力下降。3.JWDSS可对抗AD模型的行为学改变,改善模型大鼠的学习、记忆能力。4.JWDSS可抑制AD模型脑内病理生理变化,抑制模型大鼠海马小胶质细胞的活化,抑制模型大鼠海马IL-1β、IL-6、TNF-α等的过表达,进而抑制炎症反应,从而对抗AD,这可能是该复方治疗AD的作用机制之一;JWDSS还可使Aβ1-42所致p-tau蛋白过表达减少,从而抑制NFT的形成,这可能是其对抗AD的另一机制。