毕赤酵母表达系统是通用的、高效的外源蛋白表达系统，广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白、研究蛋白的表达和分泌机制。随着基因测序技术的发展，转录组学研究成为基因表达调控的主要方法。然而，基因的转录水平和蛋白表达水平并不是完全一致，从基因到蛋白需要进行转录、翻译和翻译后修饰。蛋白质组学能对不同性能的蛋白质进行系统性研究，并可以比较不同蛋白表达条件下各种蛋白的结构、功能及生物调控系统的变化。因此，蛋白质组学成为蛋白表达调控机制研究的重要手段。质谱技术的快速发展及毕赤酵母基因组测序的完成，为毕赤酵母的蛋白质组研究提供了理论基础。本研究利用iTRAQ技术对重组毕赤酵母细胞的蛋白组进行研究，从中探讨外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的调控机理。基因剂量是影响外源蛋白表达的重要限制因素之一，通过增加基因拷贝数可以有效提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达。首先，对来源于Bacillus halodurans C125第10家族的木聚糖酶xyn10基因进行毕赤酵母密码子的优化。其次，通过串联表达盒和核糖体rDNA非转录基因间隔区NTS整合的方法构建得到多拷贝菌株，两种方法筛选的菌株中表达木聚糖酶最高的是携带有四拷贝的菌株。四拷贝菌株G4比单拷贝菌株G1产木聚糖酶提高了2.84倍。研究发现，在毕赤酵母中分泌表达外源蛋白时，在一定的拷贝数范围内，蛋白分泌会达到一个极限值，进一步增加基因的转录和翻译水平，外源蛋白的表达量不再增加或者反而降低。在G4菌株中过量表达剪切后的HAC1基因，能进一步增强xyn10木聚糖酶的分泌表达，所得到的G4-H菌株比G4菌株xyn10表达量提高了1.43倍。因此，通过调整基因拷贝数获得最优表达宿主的同时，过量表达辅助蛋白分泌的相关因子对增加蛋白的分泌也极其重要。筛选得到的高表达菌株G4-H菌株，在2L发酵罐进行高密度发酵，在甲醇诱导132h后，木聚糖酶的酶活可达到3361U/mL，胞外总蛋白可达到5.2g/L。通过iTRAQ蛋白质组对三个甲醇诱导产酶菌株(G1、G4、G4-H)进行分析，其中G0菌株作为对照菌株。iTRAQ得到的质谱数据与毕赤酵母基因组、蛋白组匹配情况进行统计分析，鉴定得到的特有肽段序列数为4613个，总共鉴定得到1167个蛋白质。在低表达、高表达和过量表达HAC1的状态下，鉴定得到了352个差异蛋白。对差异蛋白的GO分析和KEGG代谢途径分析发现，在低表达菌株G1中，上调的蛋白主要是能量和物质代谢，以及氨基酸代谢，这些途径为外源蛋白的表达提供必要的能量和物质供给。在高表达的菌株G4中，大量外源蛋白的表达对细胞造成了一定的压力，表现在内质网蛋白折叠和加工相关蛋白上调，氨基酸代谢和甲醇代谢相关蛋白下调。过量表达剪切后的HAC1菌株G4-H中，激活UPR机制。一方面，通过上调参与内质网蛋白折叠的分子伴侣和折叠酶，提高内质网的蛋白折叠能力，同时增加分泌途径相关的蛋白，增强蛋白的分泌。另一方面，核糖体蛋白合成相关蛋白表达下调减少上游蛋白的翻译合成速率，从而减少了进入内质网中的未折叠蛋白，因此缓解了内质网中的蛋白压力。同时物质代谢和能量代谢、氨基酸代谢途径蛋白上调。然而，过量表达HAC1基因会对菌株的生长造成一定的抑制，蛋白质组数据分析发现主要是由于参与核糖体蛋白表达的蛋白表达降低而造成的。