龋齿是一种广泛存在的慢性细菌感染性疾病,严重影响人们的生活质量。变异链球菌是目前公认的与牙齿表面软硬组织破坏密切相关的主要致龋菌。其产酸能力和耐酸性使之在菌斑酸化和釉质的脱矿中起重要作用。细胞表面蛋白抗原c（PAc）是一类存在于细菌菌体表面和细胞壁中的糖蛋白,是细菌的主要毒力因子,可以介导变异链球菌对牙齿表面的蔗糖非依赖性黏附。PAc作为疫苗抗原已被用于诱导特异性抗体产生和抑制致龋微生物定植。然而,目前还没有疫苗上市,其原因主要是在体液中诱导和维持保护性抗体水平的能力较低。大多数多肽抗原,如PAc,在没有有效的黏膜疫苗佐剂的帮助下,往往产生较低的免疫反应。因此,寻找新型黏膜佐剂旨在增强防龋疫苗的特异性免疫反应以预防龋病是亟待解决的问题。FimH是存在于多数肠道细菌表面I型菌毛末端的,能与细胞受体特异性结合的黏附素,介导细菌与易感宿主的特异性黏附作用,是细菌入侵机体的关键环节。研究表明,在进化过程中不同细菌的Fim H存在微小序列的突变,这种基因组序列上的碱基变异,被称为基因多态性,是决定个体表型及反应性等差异的极重要因素,会导致氨基酸的替换,从而改变黏附表型。其中高黏附性突变能够增强细菌黏附宿主细胞的能力,是细菌的进化性改变。由于编码区的基因突变会导致生物性状改变,因此对其进行研究具有重要意义。Fim H作为一种病源相关分子模式（PAMP）,其突变体有可能作为一种更有效的佐剂应用于现代疫苗中。在此基础上,本研究通过定点突变技术构建相关突变质粒并进行蛋白纯化,探索这些突变体对DC2.4细胞产生的表型和功能的影响,旨在筛选出有功能意义的突变体并进一步验证其作为佐剂的免疫增强效应。第一部分:Fim H及其突变体的构建和纯化实验目的:利用定点突变技术,对临床菌株中自然发生的和随机突变产生的对Fim H功能可能有意义的非同义突变位点进行筛选,并进行突变质粒的构建和重组蛋白的纯化。实验方法:采用定点突变试剂盒对Fim H重组质粒的四个突变位点进行单点突变,并对突变后的质粒进行测序验证。将测序正确的质粒p K12和携带突变位点的质粒p A25P,p G73R,p A106和p T158P转化到大肠杆菌的感受态细胞,使用适宜浓度的IPTG诱导其在大肠杆菌中表达,采用亲和层析技术进行纯化实验结果:单氨基酸突变后的质粒p A25P,p G73R,p A106和p T158P经测序验证正确。重组蛋白成功地在大肠杆菌中纯化,纯化后的蛋白经蛋白质凝胶电泳（SDS-PAGE）染色和Western blot鉴定,目的蛋白表达正确。分离纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带。结论:携带单氨基酸突变位点的Fim H突变体被成功构建并纯化。第二部分:Fim H及其突变体对DC2.4表型和功能成熟的影响实验目的:从细胞水平探究Fim H及其突变体对DC2.4分化成熟的影响以及TLR4在该活化过程中的作用。实验方法:使用CCK8法观测Fim H及其突变体对细胞存活率的影响。纯化的Fim H及其突变体刺激DC2.4细胞,流式细胞术检测细胞表面共刺激分子、MHCII分子以及TLR4分子的表达;Real-time定量PCR和ELISA检测细胞因子的m RNA水平和分泌水平。采用Farwestern和Western验证Fim H及其突变体与TLR4蛋白的相互作用。用荧光染料标记Fim H及其突变体后,与DC2.4细胞共同孵育,检测细胞对蛋白的摄取情况。实验结果:CCK8结果表明Fim H及其突变体在1～10μg/ml剂量范围内无明显细胞毒性。其中A106T和T158P显著提高了DC2.4细胞表面成熟标志分子CD40、CD80、MHCII和TLR4的表达水平,IL-6和TNF-α的m RNA水平和分泌水平也明显提高。Farwestern和western结果验证了Fim H及其突变体与TLR4的直接相互作用。荧光和流式结果表明DC2.4细胞对A106T和T158P的摄取能力更强。结论:Fim H突变体A106T和T158P通过TLR4信号促进DC2.4细胞表型成熟和分泌细胞因子;DC2.4对A106T和T158P的摄取能力更强。第三部分:Fim H及其突变体增强防龋疫苗黏膜免疫反应实验目的:通过体内实验,探索Fim H及其突变体作为佐剂能否增强疫苗的特异性抗体产生和脾淋巴细胞增殖能力,并对免疫反应类型进行初步研究。实验方法:将K12、A106T和T158P作为佐剂与PAc抗原混合经颊黏膜免疫小鼠,以MPL作为阳性对照,ELISA检验血清中Ig G（Ig G1、Ig G2a）和唾液Ig A水平。同时分离免疫小鼠脾脏细胞,体外培养,并以PAc刺激后,通过MTS检测脾细胞增殖能力。实验结果:T158P共免疫小鼠能够显著提高血清和唾液特异性抗体水平,脾淋巴细胞的增殖能力也明显增强。血清亚型Ig G1水平较Ig G2a明显升高,说明T158P与疫苗共免疫产生以Th2型为主的免疫反应。结论:T158P作为佐剂能够增强防龋疫苗的黏膜免疫反应。第四部分:Fim H及其突变体作为佐剂增强疫苗的龋齿保护能力和安全性评价实验目的:通过定菌鼠模型,探索Fim H及其突变体共免疫大鼠的龋齿保护效果及其副作用。实验方法:将K12、A106T和T158P作为佐剂与PAc抗原混合经颊黏膜免疫大鼠,以MPL作为阳性对照,在大鼠口腔接种变异链球菌S.mutans Ingbritt,建立定菌鼠模型,ELISA检验血清和唾液特异性抗体水平,计算各组大鼠龋齿计分,并对大鼠主要脏器组织进行HE染色,观察组织学变化。实验结果:T158P共免疫定菌鼠能够显著增加特异性抗体水平,并减少龋齿形成。各免疫组主要脏器组织未发现明显的成团异型性和其他异常表现,与对照组相比无明显差异。结论:T158P作为有效的黏膜分子佐剂,能增强疫苗的防龋效果,无明显的毒副作用。