本博士论文的主要贡献是：首先采用基于二维凝胶电泳的定量蛋白质组技术分析了乙肝表面抗原持续表达细胞系及其对照细胞系的差异蛋白质组,共鉴定出81个差异表达的蛋白质。通过对差异蛋白质的功能分析,发现HBsAg的持续表达干扰宿主的物质和能量代谢。一组促细胞凋亡的候选蛋白质表达上调,而抗细胞凋亡的候选蛋白质表达下调,并着重研究GRP78在HBsAg在其中的作用,揭示了乙肝病毒促宿主细胞凋亡的一种机制；随后采用血清蛋白质组分析(SERPA)和质谱联用的技术,首次高通量分析HBV慢性感染转基因鼠模型中自身抗体的产生情况,并鉴定其特异性抗原,得到HBV慢性感染自身抗体谱,为HBV慢性感染引起的慢性肝脏疾病的早期防治提供科学依据；分泌蛋白质被认为对疾病的早期检测和诊断具有极其重要的意义,而糖基化修饰在分泌蛋白质中占有相当大的比例且蛋白质糖基化在很多重要的生理和疾病过程中起重要作用。基于此,本论文利用亲水法富集糖肽结合体内标记定量蛋白质组技术,首次大规模地鉴定了乙肝表面抗原持续表达细胞上清相对于对照细胞系中分泌蛋白质及其N-型糖修饰的差异谱；最后发展了一种基于磁性材料快速质膜富集的方法,适用于细胞质膜蛋白质的大规模鉴定和寻找HBV在肝细胞质膜上受体。蛋白质组学作为当今生命科学热点与前沿,近年来得到蓬勃的发展。蛋白质组学不是对单个蛋白质或单个途径的研究,而是对整体蛋白质的表达进行大规模描述,蛋白质组学的方法使得系统地概述蛋白质表达的生物信息学成为可能。蛋白质表达的差异性分析能用来研究肿瘤发生和预测重大疾病发生,及早治疗病患。蛋白质组学筛选得到的蛋白质标志物将可作为新的标志物进一步揭示肿瘤发生的分子机制,并在药靶研究中具有潜在价值,目前被已被广泛用于研究各种疾病的发生、发展规律,并取得了很多重大成就。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝科病毒(hepadnaviridae)是世界上分布最广泛的病毒之一。据世界卫生组织统计,全球有慢性乙肝患者和无症状的表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)携带者超过3.5亿,其中约1.2亿在中国。HBV可引起宿主由无症状病毒携带状态、急慢性肝炎、肝硬化、甚至肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)等一系列病变。在乙肝病毒感染者的血清中,除了直径为42 nm的成熟颗粒外,还能检测到大量直径在22 nm,主要由病毒表面抗原和来自宿主脂类组成的亚病毒颗粒,HBsAg颗粒与病毒之比能高达1000：1。表面抗原的持续存在是所有乙肝慢性感染患者的共同特征之病人血清HBsAg P日性超过6个月即被认为患慢性肝炎,而且血清HBsAg的清除也是目前乙肝治疗的一个难点。因此,阐明慢性HBV感染的致病机制和清除HBsAg对宿主的影响,一直是人们所关心的问题。以往的研究往往是从病毒的角度来研究HBsAg的功能,或者仅限于个别细胞或个别蛋白质对HBsAg的影响。蛋白质组学的技术特点和优势恰恰弥补了这一空白。HBsAg是一种膜蛋白,由于膜蛋白的特殊理化性质,决定了HBsAg的研究一直是HBV研究中的难点问题。据文献报道HBsAg可通过囊泡分泌系统分泌到细胞外,可干扰宿主细胞蛋白质分泌功能,在宿主与病毒相互关系中发挥重要作用。针对以上问题,本论文分为五个部分展开。论文的第一章综述了HBV的蛋白质组学研究现状以及相应的蛋白质组学的主要技术方法,并提出本课题的研究方向。第二章采用双相凝胶电泳和质谱联用技术分析了稳定表达HBsAg持续表达细胞系的表达谱,寻找和鉴定差异表达的蛋白质。并在此基础上,分析表达谱变化的意义。并从整体上预测这些变化对宿主的影响。发现并成功鉴定了81个差异表达的蛋白质,其中在HepG2-S-G2田胞中38个蛋白质表达上调,43个蛋白质表达下调。对这些蛋白质在细胞系中的表达状况用western blot的方法进行了验证。用生物信息学的方法对差异蛋白质进行了功能分析,挑选了候选分子GRP78进行生物功能的验证,初步探讨了HBsAg引起宿主细胞内蛋白质差异表达的意义和可能的机制,发现了GRP78可介导HBsAg引起宿主细胞的凋亡。本部分研究为HBsAg在慢性乙肝患者中持续表达的致病机制的深入研究奠定了定的工作基础。第三章采用SERPA(serological proteomic approach/analysis)口质谱联用的技术,高通量分析HBV慢性感染转基因鼠的自身抗体的产生情况,并鉴定其特异性抗原,首次得到了HBV慢性感染自身抗体谱。从一个新的途径揭示HBV引起肝脏损伤的机制,为早期慢性肝脏疾病特异性诊断和治疗提供可能的分子靶标。第四章对于HBsAg持续表达细胞系及其对照细胞系培养上清中分泌蛋白质进行了半定量研究,考虑到蛋白质糖基化修饰在肝病中的重要作用,结合本实验室的工作基础,针对HBsAg持续表达细胞上清中的糖肽进行了富集,并采用体内稳定同位素代谢标记对蛋白质进行相对定量,消除了各次实验条件不同影响肽段离子化稳定性而造成的定量误差。从少量的样品中鉴定了一系列差异表达的分泌蛋白质。首次建立了HBsAg持续表达细胞系分泌蛋白质的差异谱并对其糖基化后修饰进行了定量分析,为进一步探索分泌蛋白质及其糖基化修饰在慢性肝脏疾病发生发展中的作用提供了前期实验数据。第五章发展了一种基于磁性纳米材料的快速高效的细胞质膜富集技术。质膜是细胞与外界环境隔离的屏障,发挥重要的生物学功能,例如细胞识别,信号传导,物质运输等。质膜蛋白质占到人类基因组表达蛋白质的30%,70%以上药物作用靶点都是质膜蛋白质。但是由于质膜的理化特性,使得质膜的纯化鉴定一直是难点也是该领域的研究热点。传统的质膜纯化鉴定方法一般都存在着价格昂贵,步骤繁琐,操作周期较长等局限。由于质膜区别于其它的细胞器,特异性地呈电负性,所以我们巧妙地将带正电的-NH4+连接在磁性纳米材料的表面,从而可以高效快速地完成对质膜的富集,全程只需30分钟。后续使用SDS-PAGE电泳进行一维分离,切胶酶解,再进行HPLC-ESI-MS液质联用分析。共鉴定了489个蛋白质,经生物信息学分析定位在质膜上的蛋白质占50%以上,从特异性和鉴定的质膜蛋白质的数量上都证明此技术路线是非常有效的。通过此方法鉴定到了29个RAS家族成员和一些可能的HBV在肝细胞表面上的受体,进一步证实了此技术路线在挖掘质膜上药物靶标的可行性。