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1研究目的激素引起的股骨头坏死已为人们所熟知。随着激素的广泛应用，其发病率呈逐年增加趋势，已占非创伤性股骨头坏死的首位。因此，对SANFH的发病机理及治疗方法机理的研究很有必要。SANFH的确切的发病机理目前尚不清楚，普遍接受的观点有如下学说：脂肪栓塞学说、骨细胞脂肪变性学说、骨内高压及静脉淤滞学说、微血管带损伤和骨质疏松等学说。这些学说都不足以说明其发病机制。目前在蛋白分子水平的研究尚未见报道。蛋白质组学是后基因组时代的一门新兴学科。差异蛋白质研究的重心在于寻找某种特定因素引起的细胞或组织样本之间的蛋白质组差异，揭示其在生理或病理过程中的变化，探察细胞或机体对环境刺激的反应及细胞调控的机制，同时对某些标志性蛋白进行定性和功能分析。一旦能够获得蛋白质组差异的足够信息，从理论上来说就可以推断造成这种变化的原因。本研究试图从激素对成骨细胞的影响中找出差异蛋白，从而阐明SANFH的发病机理。这在理论上是一个突破，也为SANFH的治疗提供理论指导。长期或大量使用糖皮质激素，血液受热煎熬而粘滞，运行不畅，或灼伤脉络血溢脉外留于股骨头局部而成瘀痹，或热舍于肾，内伐肾精，均可致骨缺血性坏死。大多数学者认为SANFH以“肾虚”、“血瘀”为主。因此，本研究根据中医“肾主骨”的理论，运用补肾的代表方六味地黄丸含药血清对激素作用下成骨样细胞的影响，从差异蛋白方面入手，阐明SANFH的发病机理和补肾法治疗SANFH的机理。2研究方法2．1实验研究2．1．1六味地黄丸含药血清对OS-732细胞增殖和分化的影响目的观察补肾中药对成骨样细胞增殖分化的影响。方法制备低、中、高剂量的六味地黄丸含药血清。10％低、中、高剂量的六味地黄丸含药血清培养OS-732细胞，显微镜下观察细胞生长情况；细胞计数和绘制生长曲线；MTT法检测细胞增殖：进行细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定。结果含药血清组细胞生长良好，中剂量组与对照组相比P＜0．05，统计学有明显差异；在细胞增殖和细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定方面，中剂量组与对照组相比P＜0．05，统计学有明显差异。结论合适剂量的补肾中药对成骨样细胞的增殖和分化有明显的促进作用。2．1．2不同浓度DMX对OS-732细胞凋亡和细胞周期的影响目的通过不同浓度DMX体外培养，分析糖皮质激素对成骨样细胞凋亡和周期的影响。方法加入低、中、高浓度DMX培养OS-732细胞，于24h和48h两个时间点进行流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡，分析细胞周期。结果24h低浓度DMX导致细胞G2+M期明显增加，与对照组相比P＜0．05，有统计学差异；中浓度在各期与对照组无明显差异；高浓度DMX对G0／G1期有阻滞作用，与对照组相比P＜0．05，有统计学差异。对照组和DMX组均出现了凋亡峰，低浓度和中浓度DMX与对照组相比，细胞凋亡率无明显差异；而高浓度组细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0．05）。48h对细胞凋亡和细胞周期无明显变化。结论糖皮质激素使用的时间和量对成骨样细胞的作用明显不同，说明小剂量糖皮质激素（生理需要量）对成骨样细胞的增殖有促进作用，高剂量糖皮质激素（超过生理需要量）对成骨样细胞的增殖和分化有抑制作用。2．1．3补肾法对激素干预成骨样细胞作用的电镜观察目的观察激素组和中药治疗组与对照组相比较，成骨样细胞形态上的改变，了解其组织学上的差异。方法对照组、激素造模组和中药治疗组培养OS-732细胞，收集细胞后固定、染色，电镜下观察细胞形态。结果激素组细胞形态发生变化，形态不规则，线粒体减少，空泡增多；中药治疗组细胞形态明显改善，线粒体及内质网明显增多。结论糖皮质激素作用可以使成骨样细胞结构发生改变，从而影响细胞的成骨功能；补肾中药可以改善成骨样细胞的形态，从而减少成骨样细胞凋亡。2．1．4补肾法对激素干预成骨样细胞作用的差异蛋白初步分析目的比较激素组和中药治疗组与对照组双向电泳图谱上蛋白点的差异，分析激素引起成骨样细胞凋亡的蛋白表达和补肾中药对凋亡细胞作用的蛋白表达变化。方法提取对照组、激素模型组和中药治疗组培养OS-732细胞的总蛋白，双向电泳，对差异蛋白点进行分析。结果激素组有7个蛋白表达下降，其中，SSP1005、SSP2301、SSP3202和SSP6501四个点最为明显，SSP5604点蛋白不发生表达：中药治疗组对上述7个点的表达均有不同程度的增强，SSP5604点明显增强。结论糖皮质激素作用可以使成骨样细胞某些蛋白表达减弱，从而造成成骨样细胞凋亡；补肾中药可以使某些蛋白表达明显增强。综上所述，补肾中药可以促进成骨样细胞的增殖和分化，改善成骨样细胞的形态结构；抑制糖皮质激素引起的成骨样细胞凋亡，增强因糖皮质激素引起的成骨样细胞凋亡所致的某些蛋白的表达。2．2临床研究目的观察补肾中药治疗SANFH的临床疗效。方法66例病人分为两组，对照组给予生脉成骨片，合并用药组给予生脉成骨片加六味地黄丸。从疼痛、功能、关节活动度及X线评价四个方面对两组进行观察比较。结果两组治疗前后总的疗效均有显著性差异。但合并用药组在缓解疼痛、改善关节活动度和关节功能方面明显优于对照组，而在X线评价无明显差异。结论补肾法是治疗SANFH两大治法之一，在活血通络的同时，加用补肾中药疗效更佳，特别在缓解疼痛、改善关节活动度和关节功能方面有一定的优势。2．3研究结论补肾中药可以促进成骨细胞的增殖和分化，改善成骨细胞的形态结构；抑制糖皮质激素引起的成骨细胞凋亡，增强成骨细胞凋亡的功能蛋白的表达，从而达到治疗SANFH的目的。临床治疗SANFH过程中，在活血通络的同时，加用补肾中药治疗在缓解疼痛、改善关节活动度和关节功能方面有一定的优势。