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第一部分 粘附分子CD44在哮喘大鼠脾脏淋巴细胞中的作用目的探讨粘附分子CD44(cell adhesion molecule 44,CD44)在哮喘大鼠淋巴细胞中的作用机制。方法以卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏雄性SPF级SD大鼠建立哮喘模型。分别提取正常对照组及哮喘组大鼠脾脏淋巴细胞,哮喘组大鼠脾脏淋巴细胞分为哮喘组(AC 组)、CD44 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)组(CD44 mAb组)、OxPAPC(TLR2/4抑制剂)组(OxPAPC组),正常对照组大鼠脾脏淋巴细胞设为对照组(NC组)。在CD44 mAb组与OxPAPC组细胞培养液中分别加入CD44mAb、OxPAPC干预培养,收集细胞。RT-PCR方法检测各组淋巴细胞CD44、TLR2、TLR4、NF-κ BmRNA 表达变化,Western blot 方法检测各组淋巴细胞CD44、NF-κ B蛋白的表达情况。结果1.病理结果显示,哮喘组大鼠肺组织较正常对照组有明显炎症细胞浸润。2.RT-PCR结果显示,哮喘组脾脏淋巴细胞CD44、TLR4、NF-κ B p65mRNA表达(分别为 1.504±0.240、2.102±0.640、1.654±0.260)较对照组(分别为 0.9974±0.158、1.248±0.688、1.025±0.198)均显著升高,P<0.05,差异有统计学意义;哮喘组TLR2mRNA表达(0.326±0.096)较对照组(0.952±0.258)显著降低,P<0.01,差异有统计学意义;CD44mAb组、OxPAPC组TLR4mRNA表达(分别为1.147±0.365、1.223±0.535)较哮喘组(2.102±0.640)显著降低,P<0.01,差异有统计学意义,CD44mAb组、OxPAPC组NF-κ Bp65mRNA表达(分别为 1.064 ± 0.328、0.951 ±0.250)较哮喘组(1.654± 0.260)均降低,P<0.01,差异有统计学意义。3.Western blot结果显示哮喘组CD44、NF-κ B p65蛋白表达(分别为 1.507±0.215、1.745±0.203)较对照组(分别为 1.002±0.078、1.012±0.091)均升高,P<0.01,差异有统计学意义,CD44mAb组、OxPAPC组NF-κ Bp65 蛋白表达(1.101±0.195、1.193±0.117)较哮喘组(1.745±0.203)均降低,P<0.01,差异有统计学意义。结论CD44单克隆抗体能够降低TLR4、NF-κ B的表达,CD44可通过TLR4-NF-κ B通路在哮喘大鼠淋巴细胞中发挥促炎症作用。第二部分 微小RNA-31通过启动子对CD44的转录调控目的筛选靶向调节人粘附分子CD44基因启动子的微小RNA(microRNA,miRNA),研究相关miRNA通过启动子对CD44的转录调控。方法1.用生物信息学方法筛选靶向调节CD44基因启动子的miRNA,培养人支气管上皮细胞(BEAS-2b),验证靶向CD44基因启动子的miRNA在人支气管上皮细胞(BEAS-2b)中分别过表达及沉默表达,48h后用实时荧光定量PCR、Western Blot、细胞免疫荧光方法检测细胞中CD44在核酸及蛋白水平的表达,收集培养液上清用ELISA法检测细胞因子IL-6、IL-8、ICAM-1的表达。2.验证结果提示miR-31靶向CD44基因启动子,用双荧光素酶报告基因法分析靶基因结合位点,构建双荧光素酶载体报告系统,分为六组:①实验组1:CD44启动子空载质粒和miR-31空载质粒共转染293T细胞;②实验组2:CD44启动子空载质粒和miR-31质粒共转染293T细胞;③实验组3:CD44启动子质粒和miR-31空载质粒共转染293T细胞;④实验组4:CD44启动子质粒和miR-31质粒共转染293T细胞;⑤实验组5:突变CD44启动子质粒和miR-31空载质粒共转染293T细胞;⑥实验组6:突变CD44启动子质粒和miR-31质粒共转染293T细胞。3.用BEAS-2b细胞经过miR-31模拟物转染后,运用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法,用RNA聚合酶II的特异性抗体亲和下拉与其联系的启动子区的DNA片段,纯化DNA浓度后,用CD44启动子区的特异性引物PCR扩增,比较在miR-31的干预下,CD44启动子区与RNA聚合酶II相连DNA量的差异。结果1.转染293T细胞48h后,各组荧光素酶结果:实验组1、2、3、4、5、6 Firefly/Renilla 比值分别为 1.000±0.0063、1.170±0.1148、1.000±0.0340、1.235±0.0680、1.000±0.0685、0.971±0.0590。实验组 1VS 实验组 2,P>0.05,实验组3VS实验组4,P<0.05,实验组5VS实验组6,P>0.05,实验组4VS实验组6,P<0.01,实验组4较实验组3及实验组6相对荧光素酶活性明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染miR-31模拟物后,BEAS-2b细胞中CD44mRNA相对含量较对照组表达上调(P<0.05),转染miR-31抑制物后,BEAS-2b细胞中CD44mRNA相对含量较对照组表达下降(P<0.05)。2.miR-31靶向调节CD44基因,在BEAS-2b中过表达miR-31可上调CD44的表达及哮喘相关细胞因子的表达,沉默miR-31可下调CD44及哮喘相关细胞因子的表达。3.ChIP结果提示CD44三个引物检测miR-31转染组和对照组中CD44启动子区与RNA聚合酶Ⅱ结合的DNA量的差异,结果显示,实验组与对照组存在显著差异,且三个引物检测的结果一致。结论miR-31通过启动子靶向调控哮喘前炎症分子CD44基因的表达,miR-31可通过调节CD44影响哮喘相关细胞因子IL-6、IL-8及ICAM-1的表达。第三部分组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过启动子对CD44的转录调控目的了解组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过启动子对CD44的转录调控,观察组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白去乙酰化酶在哮喘发病中的作用。方法1.细胞水平:培养A549细胞,构建靶基因CD44启动子质粒作为载体并将其转染至A549细胞24h后,以1μM、2.5μM、5μM浓度梯度的TSA和1mM、2.5mM、5mM浓度梯度的SB干预转染完成的各组细胞,以DMSO为阴性对照,比较在不同浓度TSA和SB的干预下,检测各组细胞CD44启动子荧光素酶的相对活性,运用定量逆转录PCR方法(qRT-PCR)检测靶基因CD44mRNA表达量的差异。2.动物实验:将32只BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组、激素治疗组和TSA治疗组,每组8只。哮喘小鼠模型采用卵清蛋白腹腔注射致敏及雾化吸入法制作,对照组采用等量生理盐水行替代注射和雾化吸入,激素治疗组和TSA治疗组小鼠在每次激发前30 min分别予地塞米松1.0 mg/kg(0.2mL)和TSA 1.0mg/kg(0.2 mL)腹腔注射。末次激发24 h后取外周血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组血清中细胞因子IL-4、IL-8和IFN-γ水平,酶联免疫荧光法(Fluorometric)测定各组外周血单个核细胞中HAT及HDAC活性。结果1.在A549细胞中,与阴性对照组相比,CD44启动子的荧光素酶活性随着TSA和SB浓度的增加而降低,提示TSA和SB均可下调CD44启动子活性。2.A549细胞在不同浓度TSA和SB的影响下,靶基因CD44 mRNA的表达水平随TSA及SB的浓度增加而逐渐下降。3.哮喘小鼠组血清中IL-4及IL-8水平较对照组、激素治疗组和TSA治疗组升高(P<0.05),IL-4及IL-8水平在对照组、激素治疗组和TSA治疗组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.哮喘组HDAC活性较对照组、激素治疗组和TSA治疗组均降低(P<0.05),哮喘组HAT活性较激素治疗组显著升高(P<0.05),HDAC和HAT活性在对照组、激素治疗组和TSA治疗组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论TSA和SB可在转录水平影响靶基因CD44的表达,并可通过启动子对粘附分子CD44发挥的转录调控作用。哮喘发病与HDAC活性下降有关,HDAC活性下降引起炎症因子分泌增多从而诱发哮喘。第四部分微小RNA-31和粘附分子CD44在哮喘患儿血清中的表达目的观察微小RNA(miRNA)-31在哮喘急性发作期及缓解期患儿血清中的表达水平,了解哮喘患儿血清miRNA-31与粘附分子CD44表达的相关性。方法收集16例哮喘急性发作期患儿、10例哮喘缓解期患儿及36例正常对照儿童血液标本,取血清后,提取总RNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测miR-31与CD44的表达水平。结果miRNA-31在哮喘患儿急性发作期血清中含量明显高于非急性发作期及正常对照儿童,其表达水平与患儿血清中CD44的表达呈正相关。结论哮喘患儿血清miRNA-31与CD44的表达呈正相关,其表达异常参与了儿童哮喘的发生发展。