锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）是一种人畜共患的动物源性钩虫。金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是基质金属蛋白酶（metarix metalloproteinases）的特异性抑制剂,广泛存在于脊椎动物与无脊椎动物体内,具有增强红细胞活性以及促进细胞生长等重要功能。鉴于TIMP对于各种生物的重要性,本研究对犬源锡兰钩虫TIMP基因进行了克隆、原核表达以及部分生物学特性的分析。首先采用“T”形滤纸法和双玻皿培养法培养钩蚴,于培养7天后收集虫体,结果显示“T”形滤纸法富集的幼虫多于双玻皿培养法,说明“T”形滤纸法的钩蚴培养效果优于双玻皿培养法。根据NCBI数据库中注释的锡兰钩虫TIMP（Ace-TIMP）基因序列设计引物,以该虫成虫c DNA为模板,RT-PCR扩增Ace-TIMP基因,利用在线软件分析其序列。结果显示,Ace-TIMP基因的ORF序列长648 bp,编码215个氨基酸;其中信号肽序列为48 bp,编码16个氨基酸。该蛋白为亲水性蛋白,有信号肽,无跨膜结构域,由1个α螺旋和7个β链折叠而成。选用pET32a表达质粒作为原核表达载体,用Eco R I与Hind III双酶切测序正确的成熟肽序列与表达载体,构建重组表达质粒p ET32a-TIMP-MP,转化至大肠杆菌E.coli Transetta（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,采用离子亲和层析柱纯化目的蛋白并测定蛋白浓度。结果显示该蛋白为可溶性蛋白,主要在上清中表达,其分子质量约为42 k Da;该重组蛋白能与His标签鼠源单克隆抗体发生特异性结合,在20 m M咪唑洗脱液中可获得较纯的重组蛋白,经BCA法测定该融合蛋白浓度为0.9 mg/m L。利用纯化的Ace-TIMP重组蛋白免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,采用间接ELISA测定其抗体滴度,Western blot分析多克隆抗体的特异性,底物酶谱法分析Ace-TIMP蛋白对MMP-2的抑制活性。结果显示抗该重组蛋白的血清效价高达1:51200,制备的多克隆抗体可与His标签抗体特异性结合,底物酶谱法显示在含有锡兰钩虫TIMP的泳道中出现蓝色条带,说明锡兰钩虫TIMP可抑制MMP-2对明胶的降解活性。本研究首次从犬源锡兰钩虫成虫中克隆TIMP基因,构建其原核表达载体并进行了体外表达,对其序列进行了多重比对和遗传进化分析,并分析了其抗原性和对MMP的抑制活性,为深入研究锡兰钩虫TIMP的生物学功能及其免疫潜能奠定了基础。