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奶牛乳腺炎是奶牛养殖业最常见的疾病之一,临床上常有较高的发病率。当环境中的致病菌侵入奶牛乳腺突破乳腺上皮紧密连接形成的物理屏障后,在乳腺内急剧繁殖扩增,导致血乳屏障破坏进而引发奶牛乳腺的炎症反应。近年来的研究发现,长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)在多种炎症过程中发挥着关键的调控作用,但其是否参与奶牛乳腺的炎症反应过程鲜有报道。实验室前期通过高通量测序发现一个lncRNA,该lncRNA在大肠杆菌处理的奶牛乳腺上皮细胞中显著下调。因在染色体上位于其相邻的编码蛋白基因富亮氨酸重复序列75A蛋白(leucine-rich repeat-containing protein 75A,LRRC75A)的反义链,且部分与LRRC75A基因互补,故将这条LncRNA命名为LRRC75A反义链lncRNA1(LRRC75A-AS1)。本研究通过CRISPR/Cas9系统敲除LRRC75A-AS1在奶牛乳腺上皮细胞中的降低,通过一系列分子生学方法和手段研究其在奶牛乳腺上皮细中的作用及机制。实验取得如下结果:1.在炎症状态下,LRRC75A-AS1在奶牛乳腺组织和乳腺上皮细胞的中表达水平明显高于正常对照组。稳定敲除LRRC75A-AS1在乳腺上皮细胞中的表达,可诱导乳腺上皮细胞形态发生改变、促进乳腺上皮细胞β-酪蛋白的分泌、抑制乳腺上皮细胞的增殖、诱导DNA损伤、增强细胞紧密连接相关蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达;敲除LRRC75A-AS1降低乳腺上皮细胞膜的通透性并抑制细菌的黏附和侵袭。此外,敲除LRRC75A-AS1抑制炎性细胞因子的表达及NF-κB通路的激活。2.RNAplex软件预测发现LRRC75A-AS1可通过碱基互补的形式与LRRC75A结合。敲除LRRC75A-AS1可明显抑制LRRC75A mRNA的表达。此外,干扰LRRC75A可导致乳腺上皮细胞膜通透性降低、细胞紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达增加、显著降低细菌对细胞的黏附和侵袭能力、抑制NF-κB信号通路的激活。而过表达LRRC75A在乳腺上皮的表达后,则得到相反的结果。表明LRRC75A基因参与了LRRC75A-AS1对乳腺上皮细胞功能的调控过程。综上所述,炎症状态下高表达的LRRC75A-AS1可影响奶牛乳腺上皮细胞形态、增殖、β-酪蛋白分泌等基本生物特性和功能;并通过LRRC75A的表达影响紧密连接蛋白表达来调节细胞通透性及细菌侵袭和粘附能力,并通过调控NF-κB通路的激活参与乳腺上皮细胞的炎症反应过程。这一研究结果为奶牛乳腺炎病理机制的研究提供了新的思路。