龋病是口腔最常见的慢性感染性疾病之一，任何国家、任何民族不能幸免，尤以儿童和老年人发病率高。微生物微妙地维护着人类口腔生态平衡和机体健康，同时作为公认的致龋因素，在龋病发生发展中扮演不可缺少的重要角色。微生物的致龋机理研究经历的100多年历程中，非特异菌斑假说、特异菌斑假说、生态菌斑假说、连续流假说体现了人类对龋病微生物的认识不断进步和深入。而以往人类口腔检出的700多种细菌，一半以上尚不能培养，在复杂的口腔微生态环境中，我们的认识只是冰山一角，对龋病病因的研究任重而道远。以DNA为基础的一系列现代生物技术研究方法，尤其是高通量测序，使我们能在微生物组层面灵敏探测疾病相关微生物的变化。本课题组前期提出龋病微生物连续流动态假说，利用基于细菌16S rRNA的基因芯片微阵列技术横向和纵向研究了开放人群和封闭人群不同龋敏感儿童个体口腔微生物组的多样性和差异，探索了致龋动物在龋病发生发展过程中口腔部分微生物的演替及致龋毒力变化。芯片微阵列基于已知菌属基因序列的探针杂交，获得的细菌种类有限，对未知菌属无法评估，而454焦磷酸测序GS-FLX Titanium系统，对基因组深度测序极具优势。“核心微生物组”是指人体某个生境的某些微生物或功能性基因存在于大部分或全部受检人群中人体，人体是否存在核心微生物组没有定论。NIH2007年发布了核心微生物组计划，检测人体5个不同部位(口腔、鼻腔、皮肤、胃肠道和女性阴道)是否存在核心微生物组，确定其变化对人体健康和疾病的影响。课题组前期工作在芯片微阵列的研究基础上初步提出了对口腔核心微生物组的支持。　　 目的：本研究在前期系列研究基础上，以封闭人群儿童为研究对象，利用基于细菌16S rRNAV1-V3区PCR扩增的454焦磷酸GS-FLX Titanium测序，从门、纲、目、科、属、种(OTU)水平对80个高龋无龋儿童与龋病密切相关的两个重要生态环境--菌斑生物膜和唾液微生物进行宏基因组分析，从生态学宏观层面探讨龋病相关差异微生物组，验证生态菌斑假说，为课题组提出的连续流动态假说提供依据、为口腔核心微生物组提供支持、为龋病病因学研究和生态防治提供新的方向。　　 方法：符合WHO取样标准的30名高龋和10名无龋儿童，取同一个体的无刺激性唾液和磨牙牙菌斑，提取全基因组DNA行16S rDNA V1-V3区PCR扩增并构建文库，加入标签序列和A、B接头后行油包水PCR扩增，产物定量均一化后上机测序。所得序列进行一系列去杂后得到优质序列与SILVA数据库比对(80％ID)，MOTHUR软件评估微生物多样性，ITOL软件构建系统发育树，使用聚类分析、单因素方差分析等进行统计学分析。　　 结果：(1)菌斑和唾液共80样本共得到856，663条序列，其中优质序列占507，502条(60％)，每个样本平均约含6347条序列，每条序列平均长度425bp。(2)80样本共检到15003种水平上的OTUs，归属于18个门，29个纲，44个目，74个科，129个属；其中菌斑含11015，归属于13个门和118种属；唾液含7509 OTUs，属于18个门129种属。(3)每个菌斑样本中微生物种型的数量范围：706至1272种(均数：781)；每个唾液微生物种型和数量范围：441至973种(均数：773.8)；菌斑和唾液每个样本所含微生物多样性无统计学差异(P>0.05)。(4)16个差异菌属在高龋菌斑组检出率高于无龋菌斑组(P<0.05)，其中包含6个优势菌属(检出率>1％)，如纤毛菌属(Leptotrichia)，普氏菌属(Prevotlla)，链球菌属(Streptococcus)，韦荣菌属(Veillonella)，放线菌属(Actinomyces)和毛单胞菌属(Comamonas)；19个差异菌属在无龋菌斑组检出率高于高龋菌斑组(P<0.05)，包含6个优势菌属(检出率>1％)，如奈瑟菌属(Neisseria)，卟啉单胞菌属(Porphyromonas)月形单胞菌属(Selenomonas)，德克斯氏菌属(Derxia)，Aggregatibacter菌属(Aggregatibacter)和孪生菌属(Gemella)。(5)在唾液组中，29个差异菌属在高龋唾液组的检出率高于无龋唾液组(P<0.05)，包含7个优势菌属(检出率>1％)，如链球菌属(Streptococcus)，普氏菌属(Prevotella)，罗氏菌属(Rothia)，颗粒链球菌属(Granulicatella)，孪生菌属(Gemella)，营养缺乏菌属(Abiotrophia)，伯杰菌属(Bergeyella)；13个差异菌属在无龋唾液组检出率高于高龋唾液组(P<0.05)，如奈瑟菌属(Neisseria)，卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，韦荣氏菌属(Veillonella)，纤毛菌属(Leptotrichia)等。(6)主成分分析显示，在口腔菌斑和唾液两个不同的生境中，二者微生物组成集中在两个不同的区域可能存在较大差异。(7)在30高龋菌斑和10无龋菌斑样本中，有18个菌属在所有菌斑样本都能检出并且占到约90％的菌斑序列，如放线菌属(Actinomyces)，Aggregatibacter，石胡荽菌属(Centipeda)，二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)，心杆菌属(Cardiobacterium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，德克斯氏菌属(Derxia)，梭杆菌属(Fusobacterium)，孪生菌属(Gemella)，颗粒链球菌属(Granulicatella)，Johnsonella，纤毛菌属(Leptotrichia)，奈瑟菌属(Neisseria)，卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，普氏菌属(Prevotella)，月形单胞菌属(Selenomonas)，链球菌属(Streptococcus)，韦荣菌属(Veillonella)；有16个菌属在30高龋唾液和10无龋唾液样本中都能检出并且占到约85-98％的唾液序列，如营养不足菌属(Abiotrophia)，放线菌属(Actinomyces)，伯杰菌属(Bergeyella)，德克斯氏菌属(Derxia)，孪生菌属(Gemella)，二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)，罗氏菌属(Rothia)，颗粒链球菌属(Granulicatella)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，Johnsonella，纤毛菌属(Leptotrichia)，奈瑟菌属(Neisseria)，普氏菌属(Prevotella)，卟啉单胞菌(Porphyromonas)，链球菌属(Streptococcus)，韦荣菌属(Veillonella)；其中13个菌属和TM7门在80菌斑和唾液样本中都能检出，如放线菌属(Actinomyces)，二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)，德克斯氏菌属(Derxia)，孪生菌属(Gemella)，颗粒链球菌属(Granulicatella)，Johnsonella，纤毛菌属(Leptotrichia)，奈瑟菌属(Neisseria)，卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，普氏菌属(Prevotella)，链球菌属(Streptococcus)，Selenomonas，韦荣氏菌属(Veillonella)。此外，在种(OTU)的水平上，有15个OTUs是所有菌斑样本共有；有19个OTUs是所有唾液样本共有。　　 结论：(1)454焦磷酸测序分析口腔微生物宏基因组与较前期使用的基因芯片技术，获得极为丰富的生物信息，发现更多未知的疾病相关菌；(2)封闭人群儿童口腔微生物组多样性高于唾液微生物多样性；(3)牙菌斑和唾液微生物的检出率在高龋与无龋人群存在很大差异，多种检出率高或低的菌属与龋病的发生可能存在正相关或负相关关系，龋病是多种细菌共同作用的结果，支持“生态菌斑假说”；(4)龋病不是一种或两种特异致病菌引起，口腔微生物的复杂性难以想象，大量龋病相关微生物致病性需要深入研究，才能了解致龋微生物连续流动态变化的全貌；(5)支持口腔核心微生物组存在；(6)未来龋病病因的研究应该站在生态学的整体层面上，以宏观生态学的思想和方法，从宏基因组及差异蛋白组学角度来认识微生物在龋病发生发展中的作用。