M通道是电压及配体依赖性的慢激活、非失活、慢去活的电压门控性钾通道。KCNQ2~5这四个亚型构成的同源或异源四聚体是构成神经元M通道的分子基础，对维持神经元静息膜电位、调节神经元兴奋性和调节突触传递等神经生理活动有着重要的意义。KCNQ2~5亚型基因分别位于不同的染色体上，除了第五个亚型以外，其他亚型的突变均发现与人类遗传疾病相关，如良性家族性新生儿惊厥（benign familial neonatalconvulsions, BFNCs）和癫痫，先天性耳聋等。近年来研究发现，神经元M电流参与了慢性疼痛和炎性疼痛的的信号转导。神经元和外周痛觉感受器M通道的抑制将会导致神经元去极化且兴奋性增高，从而引发疼痛。由多个通路介导的M电流抑制是疼痛产生的机制之一，增强KCNQ/M通道功能（如提高KCNQ/M通道转录水平和开放M通道等）可以明显减轻疼痛。KCNQ开放剂对多种神经病理性疼痛模型及炎性疼痛模型都具有很好的疼痛预防及治疗作用。神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)是最早被发现的神经营养素家族成员，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。这些生物学作用多是一种慢效应，然而近年来越来越多的证据表明，神经生长因子还表现出快速的调节作用，如神经递质的释放，突触的传递，离子通道功能和神经元兴奋性等，以往的研究认为NGF可以调节钠通道和钙通道以及钙激活的钾通道影响神经活动。我们的前期研究发现NGF还可以抑制大鼠颈上交感神经节（superior cervical ganglion, SCG）和脊髓背根神经节（dosal root ganglion,DRG）神经元记录的M电流，提示M通道可能会成为NGF调节神经兴奋性的新途径。而对于三叉神经节（trigeminal ganglion, TG）神经元上是否能记录到M电流及NGF又有怎样地调节它？这对于研究TG神经元电活动相关的神经病理性疼痛——三叉神经痛有重要意义。本课题旨在TG神经元上验证M电流存在的基础上，观察NGF对其调节规律，并在三叉神经痛动物模型上观察NGF受体和M通道表达水平变化，为三叉神经痛治疗提供帮助。目的：从TG经元上记录M电流并进行验证，在原代细胞和表达系统观察NGF对它的调节规律，并制备三叉神经疼痛动物模型，观察NGF受体和M通道表达变化，进而分析NGF通过这一途径参与神经病理性疼痛发挥作用的可能性。方法：(1)质粒cDNA的扩增与提取： KCNQ2、3， TrkA基因克隆在pcDNA3.0质粒，GFP基因克隆在pEGFP-N1质粒，用TOP10感受态细菌转化、扩增之后用试剂盒提取，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计鉴定质粒的纯度与浓度。(2)大鼠三叉神经节神经元分离及M电流的鉴别：急性分离乳鼠TG神经细胞，24小时后采用穿孔全细胞膜片钳记录方式，对去活尾电流进行鉴别，用KCNQ通道特异性开放剂RTG和特异性阻断剂XE991进行观察。利用KCNQ亚型对TEA的敏感度不同，分析TG神经元上所表达的亚型，再用western blot技术对典型的KCNQ2亚型进行验证。(3)在表达细胞上，通过将KCNQ2、3，TrkA及GFP质粒共转染于HEK293B细胞，记录NGF激活TrkA受体实现对KCNQ2/3电流的调节作用。(4)在原代培养的TG神经元细胞上观察神经生长因子（NGF）激活其受体后对M电流的作用，对不同浓度NGF进行研究，计算EC50，并与表达系统观察到的现象进行比较分析。(5)用电流钳方式记录神经动作电位，通过观察不同浓度NGF和工具药物对TG神经元放电模式的影响，分析NGF对神经放电活动的调节作用是否与M电流的调节变化一致。(6)通过眶下神经缩窄环（ION-CCI）手术制备三叉神经痛（trigeminalneuralgia, TN）模型，取三叉神经半月节，用免疫组化方法，观察TrkA受体及KCNQ2通道蛋白表达水平变化，分析NGF调节。结果：(1)质粒提取与鉴定结果：克隆在pcDNA3.0(5.4Kbp)载体上的KCNQ2、 KCNQ3、 TrkA质粒电泳条带和绿色荧光蛋白pEGFP-N1(4.8Kbp)质粒的电泳条带均在5000bp左右。ND-1000紫外/可见光分光光度计测得质粒DNA的浓度值，其中KCNQ2、KCNQ3浓度均在400~600ng/μL之间， GFP和TrkA均在200~400ng/μL之间；OD260/OD280值均在1.8~1.9之间。(2) TG神经元M通道的验证：以记录M电流的标准protocol：钳制电压在-20mV，跃迁至-50mV持续1s，再回到-20mV，分析-50mV段的慢去活尾电流（非失活的M电流）。M通道特异性激动剂RTG可以增大去活尾电流的水平，且这种激动作用可被M通道特异性阻断剂XE991完全抑制至更低水平。10μM RTG可以使M电流升高至173.98±21.43%，有显著性差异（P<0.05，n=3）；3μM XE991可使M电流降低至19.97±7.58%，有极显著性差异（P<0.01，n=3）。以不同浓度的TEA溶液（0.03~30mM）抑制M电流帮助判断M通道亚型，并用Logistic方程进行拟合，得到TEA对该尾电流的量效关系曲线，同时求得TEA的半数抑制浓度IC50为3.87±1.33mM，相关系数R2为0.99739。膜蛋白的Western blot结果显示，三叉神经半月节部位KCNQ2蛋白的免疫印迹条带明显，分布在100kD左右。(3) NGF通过TrkA受体对表达的KCNQ2/3电流作用：记录的Protocol为钳制电压-80mV，去极化至-20mV并持续1s，再复极化至-60mV持续800ms。分析-20mV段的稳态激活KCNQ2/3电流大小。NGF(20ng/mL)可以抑制药前水平到77.9±9.46%(P<0.05, n=3)，再恢复至83.4±4.67%(P<0.05, n=3)，但抑制后水平与恢复后水平相比无显著性差异(P>0.05, n=3)。不同浓度NGF(20、40、80ng/mL)依次给药，三个浓度都表现出了较为明显的抑制作用，而且抑制后的电流很难恢复或恢复很小一部分。衡量稳定后电流大小，以80ng/mL NGF下激活电流的终水平作为最大抑制效应，20ng/mL NGF抑制达到30.6±4.00%的抑制效应，40ng/mL NGF为69.6±5.11%，与药前比均具有极显著性差异（P<0.01,n=5）。用Hill方程拟合得到半数抑制浓度EC50为32.8ng/mL。(4)原代培养的TG神经元上记录M电流，NGF抑制作用明显，NGF的浓度梯度设为0.02、0.1、1、10ng/mL，测量给药后出现的最低值作为NGF抑制最大值，将10ng/mL NGF的抑制作用设为100%（标准化），用Hill方程进行拟合量效曲线，求得EC50为0.0194±0.0047ng/mL。NGF在原代细胞上的反应性明显增强。一个很有意思的现象是，当NGF浓度增大时抑制的电流恢复的比较明显，如果与药前比较，恢复稳定后测量，20ng/mL的NGF可以恢复到原来的114.6±3.35%(P<0.05，n=3)。(5) NGF对动作电位的影响，以电流钳方式记录，500ms电流诱发动作电位，以50pA递增的跃阶形式确定阈电流水平，再以1.5倍或3倍水平进行记录。结果表明，0.02ng/mL和0.1ng/mL对TG神经元动作电位个数的影响显著：从3.2±0.2分别增加到4.63±0.18和13.86±0.50(P<0.01，n=4)。2ng/mL由对照的4.5±0.3个增加到7.8±0.5个，10ng/mL以上基本达到约10个Spike的最大值，静息膜电位水平随NGF随浓度增大而逐渐向去极化方向改变。(6)大鼠三叉神经痛（trigeminal neuralgia, TN）行为学实验结果：成功建立了眶下神经紧缩结扎（ION-CCI）的三叉神经痛模型。模型组大鼠与手术前相比，鼠术侧（CCI-ipsi）第6天开始痛阈明显降低，第9~12天降至最低；非术侧（CCI-Ctrl）第9天痛阈明显降低，直到第12天均有显著差异；与假手术组比较，模型组动物术侧痛阈从第6天开始降低（P<0.05），9~12天更明显(P<0.01)。(7)免疫组化结果：神经元胞体在三叉神经节内不同段分布不同，且无相对集中的密集处。TrkA受体和KCNQ2通道单位均在细胞膜上高表达，胞内较少。模型组术侧与假手组相比，TrkA受体的density(P<0.01)、积分光密度值（IOD，P<0.05)和阳性细胞率(P<0.05)都显著升高；KCNQ2蛋白三个参数有升高趋势，但无统计学差异，但只有IOD值有统计学意义（P<0.05）。模型对侧TrkA和KCNQ2与假手组相比三个参数均分别有所升高和降低，但是都只有IOD值有统计学意义（P<0.05）。模型术侧与对侧相比，只有density值有显著性差异（P<0.05）。结论：三叉神经节（TG）神经元上确有M通道表达，而且KCNQ2/3亚型是构成M电流的主要成分，对TG神经元兴奋性起重要调节作用，而且NGF对M电流的调节作用很敏感。在三叉神经痛时，TrkA受体蛋白表达水平会上调，NGF可能会通过上调的受体进一步增加对M电流抑制性调控。