SiRNA阻断AQP4基因表达抑制脑梗死大鼠脑水肿的DTI研究

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背景和目的:  中国脑卒中的发病率约为3‰,致残率位居首位,严重影响国民的生活及健康。脑缺血性卒中继发的脑水肿常引起颅内高压、脑疝等,是脑中风患者急性期死亡的常见原因之一。脑梗死后遗症严重影响病人的生活质量,又缺乏有效防治方法,目前,脑梗死后脑水肿多采取保守治疗。迄今已在脑内发现多种AQPs蛋白。其中AQP4蛋白是中枢神经系统内表达最多的亚型,广泛分布在脑组织与液体腔隙的接触面上。AQP4的这种分布规律提示AQP4在大脑水平衡的调节中起了举足轻重的作用。因此,AQP4水通道蛋白逐渐成为临床药物研究的热点。  本文以大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型为基础,测量梗死区DTI参数,从而探究其与AQP4基因表达的相关性,并通过慢病毒介导的SiRNA阻断AQP4基因表达抑制MCAO大鼠脑水肿,进一步探讨其对大鼠梗死后的神经功能的保护作用及其影像表现。  材料与方法:  1、将40只健康雄性SD大鼠(体重270g-300g),随机分成四组(每组10只):MCAO组:参考Longa法制备模型;假手术组:方法同MCAO组,但线栓并未阻塞大脑中动脉;生理盐水组:MCAO制作两周前,向大鼠左侧侧脑室注入生理盐水5μL;慢病组干预组:同生理盐水组,向大鼠左侧侧脑室注入siRNA5μL。模型制作成功后分别在1h、3h、6h、12h、24h时间点对各组大鼠进行神经功能评分(modified neurological severity score,mNSS)和磁共振图像采集。图像采集使用美国GE Discovery MR7503.0T扫描机及上海晨光8通道大鼠专用线圈,固定大鼠头部,扫描中心以视交叉为准,头先进,仰卧位。扫描序列如下:T1WI、T2WI、DWI、DTI等序列。测量梗死区的ADC值和FA值;  2、再取40只大鼠(每组10只),在上述时间点分别取大鼠梗死侧脑组织标本,用Western blot法检测标本缺血核心区的AQP4的表达量;  3、另取40只大鼠(每组10只),对应于上述时间点取大鼠梗死侧脑标本,免疫组化染色,测定AQP4的表达量;  4、使用统计学软件SPSS21.0进行数据分析,采用x?s记录均数资料。不同组间比较,利用单因素方差分析,组间两两比较使用LSD检验;同一组不同时间点比较,利用重复测量方差分析。相关分析采用Spearmen相关分析,检验水准为α=0.05,P<0.05表示差异具有统计学意义。  结果:  1、缺血后1h、3h、6h、12h、24h,慢病毒干预组的mNSS评分较MCAO组低,差异具有统计学意义(P<0.05);  2、MCAO组及生理盐水组的梗死区ADC值、FA值均低于假手术组。12h降至最低,随后略有升高。缺血后各时间点慢病毒干预组的ADC值、FA值均较MCAO组升高,且差异有统计学意义。ADC值、FA值在各个时间点的差异均具有统计学意义(P<0.05);  3、MCAO组、生理盐水组缺血后与假手术组相比,不同时间点病灶区AQP4蛋白阳性表达均较高;慢病毒干预组各个时间点的AQP4蛋白表达较MCAO组有所减低,且在1h、3h、6h、12h、24h时间点差异均具有统计学意义(P<0.05);  4、各组手术组大鼠mNSS评分与AQP4蛋白表达及缺血性脑梗死核心区的FA值存在负相关。  结论:  1、脑梗区AQP4的表达参与脑水肿的形成及神经功能的损伤;  2、慢病毒介导的siRNA抑制AQP4基因表达,减轻梗死区水肿,发挥梗死后的脑保护作用;  3、DTI能直观检测脑梗区的改变及慢病毒注射对基因的抑制作用。
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