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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是2016年由美国首次报道的一种新型猪圆环病毒,关于该病毒的病原学特征、致病机理尚不清楚。为掌握该病在我国的流行特征、遗传演化规律及其致病性,本研究通过不断优化PCV3的分子检测方法,先后建立了常规PCR、PCV2与PCV3鉴别诊断PCR和Taq Man荧光定量PCR方法,利用建立的PCR检测方法对2016～2021年11169份临床样品开展PCV3感染情况调查,分析其分子流行特征;通过病毒分离及仔猪感染试验验证PCV3的致病性,共取得如下成果:1.猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立本研究共建立3种PCV3的PCR检测方法,其中常规PCR方法和Taq Man荧光定量PCR方法是以PCV3 ORF2为目的基因建立,利用构建的p MD-18T-PCV3-ORF2重组质粒验证常规PCR和Taq Man荧光定量PCR的最低检测限分别为6.0×10~3copies/μL和4.13×10~1copies/μL;为区分PCV2和PCV3的混合感染,建立了PCV2和PCV3鉴别诊断PCR方法,该方法是通过分析PCV2和PCV3的全基因序列,针对两者保守和重叠区域设计简并引物,达到仅用一对引物单次扩增完成PCV2和PCV3同时检测的目的,该方法对PCV2和PCV3最低检测限分别为2.65×10~3copies/μL和2.45×10~3 copies/μL,3种PCR方法敏感性和敏感性良好,可用于不同情况下PCV3的病原检测工作。2.2016～2021年猪圆环病毒病原学调查利用建立的PCV3 PCR方法完成2016～2021年生猪养殖-销售-屠宰环节的967场次的11169份临床样品猪圆环病毒病原学调查。2016年发生繁殖障碍疾病的35个猪场中24个猪场的77份样品检测为PCV3核酸阳性,PCV3感染的场阳性率和样品阳性率分别为68.6%（24/35）和34.7%（77/222）;222份样品同时检测PCV2,其中138份样品为PCV2核酸阳性,其中35份样品PCV2和PCV3核酸均为阳性,两者的样品混合感染率为15.8%（35/222）。以上病原学调查结果证明PCV3在我国广泛存在,且与PCV2存在混合感染。利用PCV2和PCV3的鉴别PCR方法检测2016～2021年间收集的537个猪场的2894份疑似猪圆环病毒感染的样品:PCV2和PCV3感染的场阳性率分别为45.62%（245/537）和33.52%（180/537）,混合感染的场阳性率为21.60%（116/537）;PCV2和PCV3感染的样品阳性率分别为34.45%（997/2894）和24.95%（722/2894）,混合感染的样品阳性率为12.72%（368/2894）。其中各饲养阶段猪只均可检测到猪圆环病毒,其中PCV2和PCV3分别在育肥猪和种猪的检出率最高,为47.36%（206/435）和37.24%（264/709）;PCV2在死胎中检出率最低,为11.78%（35/297）,PCV3在保育猪的检出率最低,为16.01%（114/712）。利用Taq Man荧光定量PCR方法检测了湖北省2019年调运生猪和2020～2021年湖北、湖南、四川和重庆四省市屠宰的育肥猪中PCV3的感染情况。2019年湖北省调运生猪的6943份抗凝血样品来自湖北省13个地市274家猪场,结果可见PCV3感染的场阳性率和猪只阳性率分别为22.26%（61/274）和4.55%（316/6943）,保育猪和育肥猪的猪只阳性率分别为5.33%（94/1764）和4.28%（222/5179）,秋季和冬季的PCV3检出率最高,分别为7.86%（99/1259）和12.02%（63/524）。2020～2021年湖北、湖南、四川和重庆四省市中50个屠宰场采集的121个场次370头屠宰育肥猪对应的不同类型样品（抗凝血、脾脏和腹股沟淋巴结）,发现PCV3感染的场阳性率和猪只阳性率分别为52.07%（63/121）和35.68%（132/370）,其中抗凝血、脾脏和腹股沟淋巴结的检出率分别为12.70%（47/370）、20.27%（75/370）和23.78%（88/370）。本研究在2016～2021年间测定了295株PCV3 ORF2基因序列,其中PCV3a基因亚型所占比例分别为30.95%（13/32）、13.04%（6/46）、21.74%（10/46）、31.82%（7/22）、52.27%（23/44）和40.95%（43/105）;PCV3c基因亚型所占比例分别为46.88%（15/32）、67.39%（31/46）、23.91%（11/46）、59.09%（13/22）、13.64%（6/44）和45.71%（48/105）,为优势基因亚型。3.猪圆环病毒3型的致病性研究本研究成功分离1株PCV3毒株,命名为PCV3/CH/HB/XY/2018,全基因组测序分析表明该毒株属于PCV3a基因亚型。采用PCV3阳性病料匀浆液和第8代病毒细胞培养液分别感染28日龄断奶仔猪,每组试验猪5头,感染途径采用滴鼻和肌肉注射2种相结合的方式,设空白对照组。通过对试验猪的临床表现、体温、体重、病毒血症、病毒的组织分布和病理变化等方面评价仔猪感染试验结果,发现PCV3阳性病料匀浆液和病毒细胞培养液在感染仔猪后均会引起仔猪出现体温上升、消瘦、皮炎和生长缓慢等现象;病毒血症最长可持续超过14d,故血液样品可作为临床监测样品;病毒的组织分布结果表明PCV3主要感染扁桃体、淋巴结等重要免疫器官,在脾脏、肾脏和扁桃体等组织中的病原含量最高,引起肺脏出现间质性肺炎、淋巴小结增生和嗜酸性粒细胞增多等病理变化。综上所述,本研究建立了检测PCV3的常规PCR、PCV2和PCV3鉴别诊断的PCR以及Taq Man荧光定量PCR 3种病原检测方法,并利用这些方法完成了PCV3在繁殖障碍性疾病中的感染情况调查、2016～2021年猪圆环病毒的病原学调查、2019年湖北省调运生猪和2020～2021年屠宰育肥猪只中PCV3的感染情况调查。成功分离1株PCV3a基因亚型的病毒,分别用阳性病料匀浆液和病毒细胞培养液感染28日龄断奶仔猪,感染试验中猪只均出现不同程度的消瘦、被毛粗糙和皮炎等临床症状,证明该毒株对断奶仔猪有致病性,为PCV3的诊断和致病性研究奠定了基础。