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第一部分双特异性抗体M802的构建及特性检测目的:构建及纯化靶向HER2/CD3的双特异性抗体M802,并检测M802的相关特性。方法:我们采用分子克隆的方式将HER2/CD3双特异性抗体对应的各条链的编码序列克隆至真核表达载体中,然后将表达质粒转染至293F细胞中进行表达。我们收集细胞上清并通过蛋白A亲和层析和阳离子交换层析纯化得到的异二聚体,命名为M802。我们采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及高效液相色谱-体积排阻色谱来分析M802抗体。我们检测了M802抗体的热稳定性和等电点,同时使用液相质谱来检测M802抗体的分子量。此外,我们通过生物分子相互作用分析系统以及流式细胞术分别评估了M802抗体的分子亲和力及细胞亲和力。我们通过尾静脉途径将M802抗体注射到小鼠体内,在不同时间点收集小鼠外周血并通过酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测外周血中M802抗体的浓度,从而评估M802抗体的药代动力学特性。结果:M802抗体具有非对称性结构,其包括靶向CD3的单链,靶向HER2的轻链和重链且M802抗体的Fc端经过突变改造有利于异二聚体的形成。M802的纯化效率达到98%。M802抗体的分子量为127.7KDa。M802抗体的等电点为8.5,不同于其他单链或同二聚体的等电点。M802抗体的热稳定性与Herceptin（靶向HER2的单克隆抗体）及L2K（靶向CD3的单克隆抗体）相当。M802与HER2分子的亲和力为5.78×10-10M和Herceptin与HER2分子的亲和力(1.14×10-10M)相近,而M802与CD3分子的亲和力(Kd=7.12×10-8M)则明显低于L2K与CD3分子的亲和力(Kd=1.23×10-9M)。M802抗体与HER2阳性细胞的亲和力与Herceptin相差不大,但是M802与CD3阳性细胞的亲和力明显低于L2K。M802抗体能够同时结合HER2阳性细胞以及CD3阳性细胞。M802抗体在小鼠体内的半衰期为63.665±1.655h。结论:M802抗体的非对称结构,聚合物间不同的等电点以及Fc段的改造均有利于双特异性抗体的正确表达及高效纯化。M802抗体可以同时识别并结合HER2阳性细胞及CD3阳性细胞,有利于M802抗体特异性地发挥杀伤作用。第二部分双特异性抗体M802的抗肿瘤作用及机制研究目的:检测M802抗体在体外及体内实验中对HER2阳性肿瘤的抑制作用,并探索其发挥肿瘤抑制作用的相关机制。方法:我们采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE）及碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色结合流式细胞术评估M802在体外杀伤体系中对于肿瘤细胞及非肿瘤细胞的杀伤作用。我们通过细胞增殖/毒性（Cell counting kit-8,CCK-8）实验,Annexin V/PI凋亡检测实验以及蛋白免疫印迹实验分别验证M802抗体的抗HER2端对HER2阳性细胞的增殖,凋亡以及信号通路调控的作用。我们采用流式细胞术以及ELISA分别检测了M802的抗CD3端对免疫细胞的活化（检测T淋巴细胞活化标志:CD25及CD69）及细胞因子分泌的作用。同时,我们借助NK细胞在体外检测了M802抗体介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）。此外,通过小鼠皮下移植瘤实验,我们检测了M802抗体及其替代分子M806抗体（靶向人HER2及小鼠CD3）在体内对于HER2阳性肿瘤的抗肿瘤作用,并通过免疫组化染色检测肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）。结果:在体外杀伤体系中,M802抗体能够特异性地杀伤HER2阳性肿瘤细胞。M802抗体不仅抑制HER2阳性肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,而且对HER2下游的信号通路有明显抑制作用。M802抗体的CD3端能够促进T细胞的活化并促进细胞因子的释放。此外,M802抗体的Fc段还能介导ADCC效应。在皮下异种移植瘤小鼠模型中,M802显著抑制了NCI-N87肿瘤的生长。在皮下同种移植瘤模型中,M802抗体的替代分子M806抗体显示出明显的抗肿瘤作用并促进免疫细胞向肿瘤组织浸润。结论:M802抗体在体内体外实验中对HER2阳性肿瘤均有明显抑制作用。M802抗体不仅保留了抗HER2端对于HER2阳性细胞增殖、凋亡以及下游信号通路的调控作用,而且在抗CD3端能够明显促进免疫细胞活化及细胞因子分泌。同时,M802抗体的Fc端可以介导ADCC。因此,M802抗体具有三重抗肿瘤作用。第三部分PD-1/PD-L1抑制剂与M802的联合抗肿瘤作用及机制研究目的:通过体内及体外实验来评估程序性死亡受体1（Programmed death-1,PD-1）/程序性死亡受体配体1（Programmed death ligand-1,PD-L1）抑制剂对M802抗肿瘤的增效作用并探索其作用机制。方法:我们通过流式细胞术检测了多个细胞系表面的HER2及PD-L1的基础表达水平。我们对HER2及PD-L1双阳性的肿瘤细胞JIMT-1进行了M802联合抗PD-1或PD-L1单克隆抗体（αPD-1或αPD-L1）的体外杀伤实验。我们检测了杀伤体系中靶细胞的PD-L1表达量及效应细胞的PD-1表达量。同时我们收集体外杀伤上清来刺激肿瘤细胞并检测PD-L1。我们通过荧光素酶报告基因实验来检测αPD-1或αPD-L1联合M802对CD3阳性细胞的激活作用。在体内实验中,我们通过同种移植瘤模型来评估M806联合αPD-L1的抗肿瘤作用。结果:JIMT-1细胞在基础水平上有明显的HER2及PD-L1的表达,因此我们选择JIMT-1细胞来进行体外杀伤实验。M802联合αPD-1或αPD-L1并未表现出明显的增效作用。在第二部分的研究中,我们发现杀伤体系上清中IFN-γ含量显著升高。我们收集M802刺激后的无细胞杀伤上清并作用于JIMT-1细胞,发现JIMT-1细胞中PD-L1表达明显增加。荧光素酶报告基因实验结果显示,在体外杀伤体系中αPD-1及αPD-L1能够明显促进M802对CD3阳性细胞的活化。同种移植瘤实验中,M806联合αPD-L1能够显著抑制B16-HER2肿瘤的生长。联合组中,75%（6/8）的小鼠未生成肿瘤。结论:与单药治疗组相比,M806联合αPD-L1具有协同抗肿瘤作用。在体外实验中,M802明显促进肿瘤细胞中PD-L1的表达,且αPD-1及αPD-L1增强了M802对CD3阳性细胞的活化作用。综上,我们认为M802联合PD-1/PD-L1抑制剂有望成为HER2阳性肿瘤的新治疗策略。