背景和目的结直肠癌(colorectal cancer)是常见的恶性肿瘤之一,在我国,随着经济的发展、生活方式尤其是饮食结构的改变,结直肠癌的发病率呈明显上升的趋势。其发病率和死亡率在恶性肿瘤发病和死亡谱中位居第3和第5位。我们知道,结直肠癌的发病是多因素、多步骤的复杂过程,结直肠癌发病早期,经过手术治疗大约90%的病人可以被治愈,但大多数的病人在确诊的时候已经是疾病晚期,预后差。因此,加强对结直肠癌发病机制的基础研究,发现和鉴定出具有高度特异性和敏感性的结直肠癌分子标志物,从而提供结直肠癌发生预警、预后判断以及干预的新靶点,对于提高结直肠癌治愈率具有重要的意义。微小RNA (microRNA)的发现是21世纪一个突破性的科学发现,大量的研究显示miRNA在肿瘤的发生发展及相关转移中发挥着重要的作用。miRNA是一种大小约17～25个核苷酸(nucleotide, nt)的非编码单链小分子RNA,也是一组不编码蛋白的短序列RNA,广泛存在于真核生物中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因的表达,从而诱导其靶点mRNA的降解或翻译抑制发挥作用。miRNA参与调控细胞的分化、生长、发育、增殖、代谢、凋亡等功能,其表达失调将导致重大疾病,如肿瘤的发生。研究显示miRNA与肿瘤的发生密切相关,在人类癌症中存在各种miRNA的异常表达。miRNA在肿瘤发生中可以起到原癌基因或抑癌基因的作用。miRNA通过调控细胞增殖、细胞迁移及侵袭、上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)、血管生成及细胞凋亡等过程参与肿瘤的发生、发展和转移等进程。近年来,越来越多的研究表明,在结直肠癌的发生发展过程中伴随着miRNA的表达失调。miRNA在结直肠癌的发生发展过程中通过调控癌基因或抑癌基因起作用,还有些癌基因或抑癌基因通过调控miRNA发挥作用。大量的研究显示miRNA也参与了Wnt信号通路的调控,WNT/β-catenin信号通路在结直肠癌的发生发展及转移中发挥了重要的作用。研究显示,在结直肠癌细胞中microRNA-145能通过靶向catenin delta-1调节WNT/β-catenin信号通路发挥作用。此外,在口腔鳞状细胞癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌中均有研究发现miRNA能通过作用靶基因调控WNT/β-catenin通路参与肿瘤的发生及转移。本课题组在前期研究中通过基因芯片分析发现miR450b-5p在结直肠癌组织中具有差异表达。基于前期的筛选,本课题进一步明确miR450b-5p在结直肠癌组织和细胞中的表达,分析miR450b-5p在结直肠癌临床预后中的作用,探讨miR450b-5p对结直肠癌细胞生物学特性的影响,并研究miR450b-5p发挥生物学功能的分子机制,为寻找新的结直肠癌发生发展的治疗靶点奠定理论基础。材料和方法1.临床标本收集收集南方医科大学附属南方医院结直肠癌组织90例,结直肠癌及配对正常肠粘膜组织(至少距离癌灶边缘5cm以上)30例,所有标本均经病理确诊为腺癌,所有患者尚未接收放化疗治疗。采集前均通过南方医科大学附属南方医院医学伦理委员会批准及患者知情同意。2.细胞培养人结肠癌细胞株SW480、HCT116均采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养,293FT细胞采用5%DMEM培养,细胞均在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,当细胞状态良好时用于实验。3.实时定量PCR抽提细胞和组织总RNA,用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit或Reverse Transcription System逆转录成cDNA后,按All-in-OneTMqPCR Mix或SYBR Green法进行PCR扩增,相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。4. Western blot抽提细胞总蛋白,用BCA法进行蛋白浓度测定,按10%-13%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、ECL化学发光。5.细胞生物学实验包括平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验、MTT实验及流式细胞仪检测细胞周期。6.双荧光素酶报告基因检测实验按Dual-Luciferase(?)Reporter Assay System说明书进行实验操作,将荧光素酶报告基因载体及mimics/inhibitor瞬时转染48h后,收集细胞裂解液检测,以Firefly Luciferase和Renilla Luciferase活性的比值作为荧光素酶的相对活性。7.免疫荧光染色利用免疫荧光染色的方法检测结直肠癌细胞过表达或抑制miR450b-5p后,β-catenin在细胞浆、细胞核及细胞膜的表达情况。8.核浆蛋白分离按照Fermentas核浆分离试剂盒ProteoJETTMCytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit说明书操作,免疫印迹法检测目的蛋白在胞浆和胞核蛋白中的表达情况,其中胞浆蛋白以a-tubulin为内参对照,胞核蛋白以LaminBl为内参对照。9.载体构建(1)慢病毒载体plvthm/miR450b-5p及plvthm/miR450b-5p mutant:以人结直肠癌细胞基因组DNA为模板,扩增miR450b-5p (489bp),将该片段克隆至plvthm,得到种族质粒plvthm/miR450b-5p。再以plvthm/miR450b-5p为模板,突变miR450b-5p的作用位点,构建得plvthm/miR450b-5p muto(2) PGL3-SFRP23’-UTR-WT和PGL3-SIAH13’-UTR-WT:以正常人结直肠癌细胞基因组DNA为模板,扩增SFRP23’-UTR (492bp)和SIAH13’-UTR(429bp),分别将片段克隆至PGL3-Basic vector,得到种族质粒PGL3-SFRP23’-UTR-WT和PGL3-SIAH13’-UTR-WT。10.慢病毒包装及浓缩滴度测定采用碳酸钙沉淀法,将慢病毒表达载体和包装载体共转染293FT细胞,培养48-72h后收集上清液,上清液经离心后进行浓缩纯化及倍比稀释法滴度测定。11.细胞转染(1)瞬时转染：按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。(2)慢病毒感染：将收集的慢病毒上清液感染结直肠癌细胞,利用流式细胞仪分选获得GFP+细胞,分别建立过表达miR450b-5p的结直肠癌细胞株SW480/miR450b-5p和HCT116/miR450b-5p。(3) miRNA与质粒共转染：按LipofectamineTM2000试剂说明书进行操作,24孔板中miRNA的用量为50nM,重组质粒PGL3-SIAH1-3’-UTR和PGL3-SFRP2-3’-UTR用量为0.5ug, PRL-SV40用量为0.05ug。12.动物实验分别将SW480/miR450b-5p和对照组细胞SW480/plvthm随机接种于12只裸鼠后背部皮下,每组包括6只。每6天用游标卡尺测量肿瘤的长短径,待肿瘤体积超过900mm3,将实验动物处死,取出肿瘤组织后经福尔马林固定后进行下一步实验。13.免疫组化将裸鼠肿瘤组织的石蜡切片按免疫组化步骤,Ki67染色处理,检测结果半定量判定。14.统计学分析运用SPSS13.0统计学分析软件进行统计学分析。卡方检验和Spearman等级相关分析检测miR450b-5p的表达与结直肠癌的临床病理特征之间的相关性；Kaplan-Meier法绘制生存曲线并用Log-Rank检验比较生存曲线之间的统计学差异；miR450b-5p在结直肠癌组织及相对应癌旁正常肠粘膜组织中的表达采用配对样本Wilcoxon符号秩检验；MTT实验采用析因分析设计的方差分析；实时定量PCR、平板克隆、软琼脂克隆形成实验、双荧光素酶报告基因实验采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.结直肠癌中miR450b-5p表达及其与临床预后的相关性分析。采用实时定量PCR法检测30对配对结直肠癌组织中miR450b-5p的表达,结果显示相对于癌旁正常肠粘膜组织,结直肠癌组织中miR450b-5p的表达明显升高。Wilcoxon符号秩检验结果显示,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。对90例结直肠癌组织标本采用实时定量PCR法检测miR450b-5p的表达,结果显示miR450b-5p高表达与肿瘤的病理分期、分级相关(P<0.01),并且miR450b-5p高表达的结直肠癌患者的远期生存率低于miR450b-5p低表达的结直肠癌患者,差异具有统计学意义(Log-Rank检验,P=0.007)。2. miR450b-5p对结直肠癌细胞生物学行为的影响实时定量PCR检测结直肠癌细胞系SW480、HCT116、HT29、KM12、SW620、 DLD1、LS174t、M5、HCT115中miR450b-5p的表达情况,结果显示miR450b-5p在HCT116中的表达较高,而在SW480中的表达较低。瞬时转染miR450b-5p mimics和inhibitor,实时定量PCR检测结果显示SW480和HCT116在转染了miR450b-5p后,miR450b-5p的表达均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；而转染miR450b-5p inhibitor后,miR450b-5p的表达分别下降,差异具有统计学意义(P=±0.001)。以上结果显示,通过瞬时转染miR450b-5p mimics或inhibitor可以有效上调或下调miR450b-5p的表达。MTT实验结果显示,转染miR450b-5p5day后,SW480和HCT116细胞的生长速度均加快,差异具有统计学意义(P<0.001)；而转染miR450b-5p inhibitor5day后,两种细胞的生长速度分别降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。平板克隆实验结果显示,SW480/plvthm克隆形成数为15±2.645个,SW480/miR450b-5P克隆形成数为44±13.527,差异具有统计学意义(P=0.022)；HCT116/plvthm克隆形成数为113±6.111个,HCT116/miR-450b-5P克隆形成数为606±8.000个,差异具有统计学意义(P<0.001)。反之,瞬时转染miR450b-5p inhibitor后,与对照组相比,SW480inhibitor和HCT116inhibitor所形成的克隆数均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。软琼脂克隆形成实验结果显示,SW480/plvthm克隆形成数为12.3±2.5个,SW480/miR450b-5P克隆形成数为23.6±4.1个；HCT116/plvthm克隆形成数为14±3.0个, HCT116/miR-450b-5P克隆形成数为37±4.0个,与对照组相比,过表达miR450b-5p后细胞形成的克隆大,数目多,差异具有统计学意义(P<0.05)。反之,瞬时转染miR450b-5p inhibitor后,与对照组相比,SW480inhibitor和HCT116inhibitor所形成的克隆小,数目少,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与对照组细胞相比,SW480/mimics和HCT116/mimics的G1期细胞比例下降了28%和23%,而S、G2/M期细胞百分率均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。而SW480和HCT116细胞转染miR450b-5p inhibitor后使细胞发生G1期阻滞,百分率均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),且S、G2/M期细胞百分率均明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明miR450b-5p通过调控结直肠癌细胞周期改变促进细胞增殖。3. miR450b-5p过表达对结直肠癌细胞体内成瘤能力的影响利用裸鼠皮下注射法构建实验动物模型,实验结果显示,与对照组的SW480/Plvthm细胞相比,稳定表达miR450b-5p的细胞株SW480/miR450b-5p在裸鼠皮下形成的肿瘤体积明显增大,差异具有统计学意义(P<0.001)。4. miR450b-5p与SIAH1和SFRP2的3’-UTR可特异性结合,抑制其表达。共转染PGL3-SIAH1/PGL3-SFRP2、miR450b-5p mimics、miR450b-5p inhibitor和miR450b-5p-mut质粒到SW480和HCT116细胞后,双荧光素酶报告基因实验结果显示PGL3-SIAH1/PGL3-SFRP2+miR450b-5p mimics的相对活性降低；PGL3-SIAH1/PGL3-SFRP2+miR450b-5p inhibitor的相对活性增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot和qRT-PCR实验结果显示,过表达miR450b-5p后SIAH1和SFRP2的蛋白水平和mRNA水平均下调；而转染miR450b-5p inhibitor后,细胞中SIAH1和SFRP2的蛋白水平和mRNA水平均上调。以上结果表明miR450b-5p能与SIAH1和SFRP2特异性结合,并抑制其表达。5. miR450b-5p激活WNT/β-catenin信号通路,促进结直肠癌的发生。TOP/FOP双荧光素酶报告基因检测结果显示,SW480/miR450b-5p mimics和HCT116/miR450b-5p mimics中Wnt/β-Catenin转录复合体的的转录活性比对照组SW480/NC和HCT116/NC明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。而瞬时转染inhibitor后,SW480/inhibitor和HCT116/inhibitor中Wnt/β-Catenin转录复合体的的转录活性比对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。核浆蛋白分离后Western blot实验结果显示,过表达miR450b-5p后SW480和HCT116细胞核内P-Catenin的表达比对照组细胞明显增加；相反,干扰miR450b-5p后SW480和HCT116细胞核内P-Catenin的表达比对照组细胞降低。同时免疫荧光染色结果显示,对照组SW480/NC、HCT116/NC中,P-Catenin主要在细胞膜上表达,在胞浆和胞核中表达较少,而过表达miR450b-5p的SW480和HCT116细胞中,P-Catenin在胞浆和胞核内的表达明显增强；相反,干扰miR450b-5p表达后,SW480和HCT116细胞核和细胞浆内P-Catenin的表达明显降低。以上结果提示,miR450b-5p可能使P-Catenin出现胞浆积聚并转运入核,使Wnt信号通路激活。结论1、miR450b-5p在结直肠癌组织中高表达,且与结直肠癌病理分级、分期及远期预后相关。2、miR450b-5p在体内外影响结直肠癌细胞的增殖能力,参与结直肠癌的发生、发展,起着促癌基因的作用。3、SIAH1和SFRP2是miR450b-5p在结直肠癌发生发展中发挥作用的靶基因,miR450b-5p通过靶向SIAH1和SFRP2发挥着促癌作用。4、miR450b-5p可能通过增加细胞内非磷酸化P-Catenin的活性水平,使P-Catenin在胞浆中积聚并进入细胞核,从而激活Wnt信号转导通路,促进结直肠癌细胞增殖。