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牙齿是人类生长发育过程中重要的器官,牙齿损伤和牙齿脱落已成为最常见的口腔疾病,牙齿缺失会导致咀嚼、语言和美观等方面出现问题,会不同程度地影响人类的生活质量。现有传统的牙齿修复方法,存在使用寿命短、使用感受差、生物相容性差等问题。因此,如何获得在功能和形态上类似天然牙齿的再生牙齿成为目前口腔医学领域研究的热点。牙齿的发育依赖于来自口腔上皮和周围的间充质之间的相互作用,同时受到各种信号通路的调控。在牙齿形成过程中,组织之间的相互作用表现为,其中一种组织产生诱导信号,另一种组织接收并响应信号,前一种组织具有的诱导能力称为牙源性潜能(odontogenic potential)。上世纪的经典重组实验证实了牙源性潜能首先出现在牙胚上皮中,继而在蕾状期(embryo day 12-13,E12-13)转移到间充质中。可见,早期的牙胚上皮可以诱导牙源性或非牙源性的间充质形成牙齿;而蕾状期之后的牙胚间充质可以诱导牙源性上皮或非牙源性上皮形成牙齿。由此,帽状期E14.5的小鼠牙胚间充质细胞常常作为构建再生牙齿的诱导信号细胞来源。然而,新鲜分离的牙胚间充质细胞数量十分有限,大大制约了再生牙齿相关的体外构建研究。本课题组此前已发现E14.5的小鼠牙胚间充质细胞在体外培养过程中易丧失牙源性潜能(MEF培养基),通过初步优化也仅可以在体外持续维持其牙源性潜能48小时(无血清KSR培养基,knockot serum replacement,KSR)。为进一步延长体外培养的牙胚间充质细胞牙源性潜能的维持时间,明确体外培养过程中牙源性潜能变化的机制,本课题中我们在无血清的培养条件基础上进一步优化了牙胚间充质细胞的体外培养体系,并通过对优化前后的体外细胞样品进行转录组测序,从而解析体外维持牙源性潜能的关键因子,为全牙再生中启动诱导成牙信号的研究提供相关的科学依据。在本研究中,我们建立了一种新型的培养体系,即无血清新型培养基(简称NM)。通过与MEF(DMEM+10%FBS)、KSR(DMEM+20%KSR)两种培养体系的对比,我们对分离的E14.5牙胚间充质细胞在三种培养体系中的生长状态进行观察,通过实时定量PCR鉴定细胞中成牙相关基因的表达,并收集不同培养条件下不同时间点的体外培养细胞,与E14.5无诱导能力的牙源性小鼠牙胚上皮重组获得重组牙胚样品,继而移植到小鼠肾包膜中进行重组样品的成牙能力鉴定。重组样品移植3周后被取出,并进行相关的成牙情况检测及组织学鉴定。此外,我们通过转录组测序分析不同培养条件下的间充质细胞样品转录组之间的差异,从而尝试解析牙源性潜能维持的机制。实验结果显示,牙胚间充质细胞在MEF和KSR培养基中贴壁生长,形态呈长梭形;在NM培养基中细胞成簇,培养4天后部分细胞悬浮成球,这说明NM促进细胞悬浮培养,可以模拟立体培养环境。我们进一步发现,牙齿发育相关基因Dlx2、Lhx6、Lhx8、Msx2、Msx1在NM组中的表达水平高于MEF和KSR组。随着传代次数的增加,NM中间充质细胞在成牙基因的表达水平呈梯度下降,特别是Msx1的表达量下调了40%,这些数据说明了NM中体外培养的间充质细胞的牙向发育的相关能力在传代过程中逐渐丧失。重组实验移植物的组织学检测结果显示,在MEF和KSR培养基中体外培养24小时的牙胚间充质细胞,分别与E14.5牙胚上皮重组后均可以形成牙齿,且成牙率为100%,但体外培养时间超过24小时的间充质细胞与E14.5天的牙胚上皮重组后无法形成牙齿。在NM中培养1、4、7天的细胞与E14.5天的牙胚上皮重组后均获得了牙齿样结构,且呈现了较高的成牙率,分别为83.3%、58.3%和66.7%,但是NM组中传代后的细胞参与构建的重组样品无法形成牙齿。转录组测序数据显示,体外培养牙胚间充质细胞在不同培养条件下及培养时间点呈现明显的基因表达差异。其中,NM条件下培养4天的细胞组(NM成牙组)和MEF条件下培养4天的细胞组(MEF不成牙组)中Bmp4的表达呈现显著差异,即Bmp4在成牙组中呈现表达水平较低,而在不成牙组中呈现表达水平较高。为了明确Bmp4在成牙能力中的作用,我们分别对NM成牙组和MEF不成牙组的培养体系里添加了BMP4蛋白和BMP通路的小分子抑制剂DM(dorsomorphin),体外培养4天后收取细胞与E14.5牙胚上皮重组并移植到肾包膜中。3周后,我们发现NM成牙组在添加了BMP4后,成牙率由原来的90%左右降为0,而MEF不成牙组在添加了DM后,成牙率由0升高为50%。这一结果说明,BMP4蛋白的添加会抑制体外牙胚间充质细胞牙源性潜能的维持,而抑制BMP通路可在一定程度上促进体外牙胚间充质细胞牙源性潜能的维持。由此可见,Bmp4在调控牙胚间充质细胞体外培养过程中成牙能力的维持上起到了重要作用。综上所述,我们优化的NM无血清培养基,能够在体外维持牙胚间充质细胞的牙源性潜能7天,并有效提高了与E14.5牙胚上皮重组的成牙率。根据转录组测序发现,优化前后的MEF培养体系和NM培养体系中的间充质细胞在基因表达上呈现显著差异,并明确了Bmp4对调控体外培养的间充质细胞的牙源性潜能的维持起到了重要作用。本研究的结果不仅为牙胚间充质细胞的体外培养优化提供了科学依据,也为构建再生牙齿提供了维持诱导成牙能力的思路。