研究目的及背景原发性肝癌发病率逐年上升,其致死率高,且全球范围内超过一半的新发病例都在我国。目前其不仅是威胁我国国民健康的重大“杀手”,也对我国的经济发展造成巨大的压力。其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最主要的病理类型,约占比90%左右。由于交叉学科的发展,近年来肝癌的外科技术、局部消融、定向放疗及靶向治疗等均取得了重大的进展,但5年生存率并未得到实质性的提高,而治疗费用却随着治疗手段的增多呈现逐渐上升的趋势,让临床和科研工作者认识“亡羊补牢”所付出的沉重代价,并意识到研究肝癌发生过程中的相关机制,对早期预警及干预的重要性。目前,炎症是公认的恶性肿瘤第七大特征,慢性炎症所形成的免疫微环境不仅能促进肿瘤的侵袭与转移,更是肿瘤发生不可或缺的条件,越来越多的目光聚焦于肿瘤细胞与间质细胞之间的相互调控上,且随着肿瘤免疫治疗的异军突起,让炎症微环境也成为抗肿瘤治疗“方兴未艾”的研究领域。而肝细胞癌更是“炎癌转化”这一机制的典型表现,绝大部分肝癌(90%左右)的发生和发展都伴随着不同程度的肝纤维化或者肝硬化等炎症微环境的“重构”,且肝纤维化及肝硬化的程度与肿瘤的发生率呈正相关,这也充分说明了肝纤维化及硬化在“炎癌转化”中扮演着重要的桥梁作用。即使肝脏疾病谱系近年来逐渐改变,表现为糖尿病、脂肪肝等代谢性肝脏损害逐年上升,但是“殊途同归”,无论慢性肝炎感染、糖尿病、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎等何种病因,均会通过肝脏慢性坏死性炎症引发代偿性肝再生,最终导致肝硬化失代偿或者肝癌等致死性肝病的发生。此外,肝脏炎症进展为肝硬化可引起肝功能失代偿不仅让原发性肝癌的治疗更加棘手,同时肝硬化也可导致肝功能衰竭直接致死。令人失望的是,目前尚无逆转肝纤维化进程的有效方法,也让肝癌的防治难以得到突破性进展,所以考查“炎癌转化”这一连续过程中的关键调控机制,是防治肝硬化及肝癌的前沿和热点方向。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lnc RNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,近年来大量证据证实长链非编码RNA可作为广谱调控因子,可在染色体修饰、基因转录及转录后等多水平发挥调控作用,也可稳定存在于胞外的外泌体中,参与细胞间的相互调控,传递细胞转移、化疗抵抗等信息。长链非编码RNA在恶性肿瘤“炎癌转化”过程中的作用也逐步得到重视。乳腺癌细胞中的表达谱芯片结果发现LPS刺激后lnc RNA-NKILA显著上调,且NKILA与抑制性NF-κB/Iκ-Bα复合物结合,掩盖Iκ-Bα磷酸化位点,从而导致NF-κB释放、活化和易位受抑制,最终抑制乳腺癌的发生。炎症因子TNF-α可刺激卵巢癌细胞中长链非编码RNA HOTAIR(HOX Antisense Intergenic RNA’s)的上调表达,HOTAIR可诱导DNA损伤反应(DDR)促进肿瘤生成,也能降低IκBα蛋白水平,导致NF-κβ核转位和活化增加,从而进一步诱导炎症反应加重及HOTAIR的持续上调,结果表明HOTAIR-NF-κβ-DDR的阳性反馈环是卵巢癌中“炎癌转化”过程中的重要调控机制。Huang M等近期报道,长链非编码RNA-MALT1可在炎症所致的肝癌细胞增殖及转移过程中发挥作用。此外,肝内富集的长链非编码RNA-LFAR1(liver fibrosis-associated lnc RNA1)可通过参与TGF-b信号通路促进肝星状细胞的激活,而lnc RNA-p21则可作为ce RNA抑制肝星状细胞的激活,这也初步提示长链非编码RNA在肝脏“炎癌转化”中可能是不可或缺的关键分子。本课题组前期通过高通量方法筛选了“正常肝组织、慢性肝炎组织、肝硬化组织、肝癌组织”中的长链非编码RNA及信使RNA的表达谱。通过生物信息学分析,我们靶定“肿瘤发生相关长链非编码RNA组”中DANCR(Anti-differentiated non-coding RNA)可能在“炎癌转化”过程中发挥关键作用。后续我们发现肝癌细胞中DANCR激活B-catenin下游通路,增强肝癌细胞的干性,从而促进肿瘤的发生和发展,也进一步证实肝脏内DANCR的高表达可作为预测肝细胞癌根治术后预后的独立危险因素,提示DANCR可作为肝癌潜在的分子标志物。此外,虽然前文已详细阐述了肝细胞中DANCR的上调表达在肝癌发生发展中的作用,但是其在肝脏炎癌转化过程中的作用,以及肝脏间质细胞与肝细胞双向调控网络中的功能仍不明确,值得深入研究。研究方法与结果第一部分探讨肝炎、肝纤维化、肝硬化组织中DANCR表达并检测其与炎症、纤维化程度的相关性。扩大临床样本检测正常肝、乙肝肝炎及乙肝相关肝硬化组织中DANCR的表达量,发现DANCR在“正常肝脏-慢性肝炎-肝硬化”的病理进展过程中呈增高趋势。根据术后肝脏病理GS评分(G为炎症程度评分,S为纤维化程度评分)比较不同炎症及纤维化状态的肝脏样本中DANCR表达。结果显示GS评分总体较高的肝脏组织中DANCR表达较高,且炎症评分或纤维化评分越高,DANCR表达越高。新鲜临床组织中行DANCR原位杂交免疫荧光染色,明确DANCR在肝细胞中相对较高的表达丰度。且在GS评分较高的组织中,DANCR在肝细胞中呈现更高的表达。此外,通过收集不同病因所致肝炎肝硬化组织标本,检测其DANCR表达。发现除乙肝肝硬化外,在代谢性、酒精性及丙肝肝硬化组织中,DANCR表达同样增高。本课题组前期研究使用生物信息学分析比较发现DANCR在人鼠之间在关键功能区的保守性较好。构建小鼠急、慢性肝炎模型并检测小鼠肝脏Dancr表达,结果显示:在小鼠肝脏急性及慢性炎症中,Dancr表达显著增高。第二部分研究炎症与DANCR之间的调控关系,并明确调控机制首先探讨炎症调控DANCR的可能性,在体外培养人肝癌细胞及原代小鼠肝细胞,添加激活NF-κB及STAT3通路的炎症因子TNF-α及IL-6,发现DANCR/Dancr表达显著上升。在肝癌细胞系中通过慢病毒过表达NF-κB及STAT3通路转录因子P65及STAT3的表达,发现DANCR的表达量显著上升。其次研究NF-κB及STAT3通路上调DANCR表达的具体机制,将DANCR启动子区(转录起始位点上游2000bp)接入双荧光报告质粒。行双荧光报告实验证实转录因子P65及STAT3可以结合至DANCR的启动子区促进转录。根据转录因子的结合序列,预测其在DANCR启动子区的结合位点并设计特异性引物。在正常状态及炎症因子刺激状态下,分别进行染色质免疫共沉淀联合定量PCR实验。结果显示:p-P65及p-STAT3的抗体可富集DANCR启动子区片段。并且在炎症因子激活的状态下,能够观察到其富集程度进一步增加。将染色质免疫共沉淀实验中阳性的启动子位点进行突变,接入双荧光报告系统质粒进行检测。确认了P65及STAT3结合至DANCR启动子区的具体位点分别位于转录起始位点上游44bp及343bp处。最后,我们使用RNA pull-down实验并通过WB进行验证,未发现DANCR可以直接结合NF-κB及STAT3通路的转录因子。通过慢病毒在人肝癌细胞系中过表达DANCR后未观察到NF-κB及STAT3两条炎症通路的显著激活。由此说明DANCR与该两条通路间不存在正反馈调控回路。第三部分通过Dancr的基因敲除鼠的炎癌模型验证Dancr对于肝硬化、肝癌发生中的作用DANCR的序列高度保守,小鼠和人的序列同源性较高。我们构建了Dancr的基因敲除小鼠,鉴定并繁殖至模型数量。使用DEN+CCl4腹腔注射构建慢性炎症-肝硬化-肝癌的“炎癌转化”模型,结果显示:敲除Dancr可以减轻肝脏纤维化程度,敲除组小鼠较野生型小鼠相比,在同一时间节点时天狼星红染色阳性比例更低,纤维化标志分子Acta2及Col1a1表达更低。此外,敲除组小鼠的肝脏成瘤率更低、成瘤周期更长。同时在野生型小鼠中,Dancr表达与用肝纤维化程度相关,其与Acta2及Col1a1等其他肝纤维化标志分子表达相关。通过原位杂交免疫荧光实验发现野生型小鼠“炎癌转化”过程中Dancr的升高主要存在于肝细胞内,通过差速离心法分离不同时间节点野生型模型小鼠肝细胞及星状细胞并检测Dancr表达,发现Dancr在两种细胞内均有上调,但以在肝细胞中升高为主。同时小鼠血清中检测到的Dancr与肝脏中Dancr表达呈正相关关系。第四部分明确肝细胞通过旁分泌含有DANCR的外泌体从而激活星状细胞并促进肝硬化形成的过程使用超速离心法分离并纯化肝癌细胞培养基上清及模型小鼠血清中的外泌体,并通过粒径检测及电镜观察进行确认和验证。检测培养基中分离得到的外泌体,发现其中可测得DANCR存在。并且在炎症因子TNF-α及IL-6刺激后的同体积肝癌细胞培养基中(对应细胞数量同为1*10~7),富集的外泌体可检测到其中包裹更多的DANCR。同样,在肝硬化小鼠的血清外泌体(300ul)中,Dancr含量高于普通小鼠血清外泌体。将分离得到的外泌体与肝星状细胞共培养,通过激光共聚焦实验观察到星状细胞对外泌体的摄取。检测发现摄取外泌体后的星状细胞内DANCR含量上升。将肝癌细胞内的DANCR进行点突变,提取外泌体并与肝星状细胞共培养后,发现星状细胞内升高的DANCR主要以突变体形式存在,表明其来源于摄取的外泌体。将DANCR干扰的肝癌细胞及对照肝癌细胞外泌体,与肝星状细胞进行低血清共培养。发现在同一时间节点内,与对照外泌体共培养的星状细胞激活程度更高。而与干扰DANCR表达肝癌细胞外泌体共培养的星状细胞激活程度较低。对分离得到的肝癌细胞培养基上清中的外泌体进行荧光染色,与星状细胞系进行体外共培养后进行流式细胞检测,发现激活标志物α-SMA阳性的星状细胞内含有更多的外泌体,说明摄取更多含有DANCR的外泌体有助于星状细胞激活。第五部分探索DANCR进入星状细胞后促进其激活的具体机制通过慢病毒在星状细胞系LX2内干扰DANCR表达,通过表达谱芯片对下游表达改变的基因进行检测,并通过go/pathway分析筛选差异基因所富集的细胞功能及细胞信号传导通路。发现差异基因在干扰素相关通路上有显著富集。随后,在干扰DANCR和对照的LX2细胞内加入不同浓度的干扰素,发现干扰DANCR可以增加干扰素γ对星状细胞增殖抑制作用,干扰DANCR的星状细胞干扰素-γ的IC50值更低。此外,在相同浓度的干扰素作用下,干扰DANCR的LX2细胞其激活标志物的表达较对照组更低,说明其激活受到更高程度的抑制。最后,通过CCl4腹腔注射建立敲除Dancr小鼠及野生型小鼠的肝硬化模型,在模型建立期间同时给与干扰素γ治疗,结果显示敲除组小鼠肝硬化程度更低,说明敲除Dancr可以显著增加干扰素治疗肝硬化的敏感性。结论根据上述结果,结合五部分内容,可以总结得到:1、通过在组织标本中的检测发现DANCR在肝炎肝硬化的病理进程中逐渐升高且与炎症和纤维化程度显著相关,并且其在多种病因所致肝硬化组织中均存在显著上调。同时在小鼠急慢性肝炎的模型中,Dancr的表达亦存在显著增高。以上结果提示DANCR可能在肝脏的炎癌转化进程中起到重要作用。2、通过细胞内分子生物学检测明确激活炎症通路NF-κB及STAT3可以在肝(癌)细胞内上调DANCR表达,其通过NF-κB及STAT3通路转录因子P65及STAT3结合至DANCR的启动子区从而促进DANCR的转录。但该两条通路与DANCR表达之间不存在正反馈调控循环。3、通过构建Dancr敲除的基因敲除小鼠并建立小鼠肝脏炎癌转化过程的模型,发现敲除Dancr后能够减轻肝硬化程度,降低肿瘤发生率及肿瘤负荷,说明其在肝脏炎癌转化中起到重要作用。并且通过在肝组织中DANCR的细胞定位及血清中的DANCR检测,推断肝细胞中升高的DANCR可旁分泌激活星状细胞促进肝硬化进程。4、通过富集肝癌细胞及模型小鼠血清外泌体并检测,我们发现肝细胞可以分泌含有DANCR的外泌体并且被星状细胞所摄取。并且在炎症状态下,这一过程显著增强,促进星状细胞进一步的激活。5、通过表达谱芯片检测干扰DANCR后的星状细胞,发现其差异表达的基因在干扰素相关通路存在富集。通过细胞功能学实验及小鼠体内实验证实DANCR可以降低星状细胞对于干扰素γ的敏感性,其可维持星状细胞的激活,促进肝纤维化的进展。