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肿瘤是严重影响人类生活质量及威胁人类生命的疾病。本论文致力于有可能成为新的抗肿瘤制剂-肌球蛋白轻链抑制剂ML-7致细胞凋亡机理，凋亡过程中Bcl-2 家族仅含BH-3功能区促凋亡蛋白Bmf的信号转导、ML-7在体内抗肿瘤作用以及与其它常用抗肿瘤药物在体外及体内抗肿瘤协同作用的研究。一、肌球蛋白轻链磷酸化与细胞凋亡 细胞支架在凋亡过程中经历剧烈变化。目前已阐明肌动蛋白在细胞凋亡过程中所介导的作用。而肌球蛋白II及其轻链磷酸化调节在细胞凋亡过程中作用尚未明了。我们的实验数据表明肌球蛋白轻链去磷酸化使肌球蛋白II功能失活是细胞凋亡机理中一重要组成部分。由于我们的实验是在原代培养的血管平滑肌细胞和细胞系进行的，因此调节性肌球蛋白轻链去磷酸化在很广泛的细胞类型都可能引起细胞凋亡。 我们的实验结果表明，应用不同的凋亡诱导剂使调节性肌球蛋白轻链去磷酸化。在我们所应用的凋亡诱导剂中，只有地塞米松未引起肌球蛋白轻链磷酸化水平的降低。尽管地塞米松在一些细胞类型中引起细胞凋亡，但<WP=128>不引起平滑肌细胞凋亡，进一步支持肌球蛋白轻链去磷酸化与细胞凋亡相关联。当应用cytochalasin D或通过诱导anoikis摧毁细胞支架时，肌球蛋白轻链去磷酸化。这表明了肌球蛋白轻链去磷酸化与截然不同机理诱导的凋亡相关联。二、抑制MLCK活性降低肌球蛋白轻链磷酸化诱导细胞凋亡我们采用两种截然不同的方法观察肌球蛋白去磷酸化致凋亡。首先，我们应用ML-7，特异性MLCK抑制剂诱导剂量依赖的肌球蛋白去磷酸化及剂量依赖的细胞凋亡。我们还发现，应用另一种MLCK抑制剂KT5926，也导致细胞支架摧毁、细胞核碎裂等典型细胞凋亡形态学变化。然后作为更为直接的方法，我们将特异抑制MLCK的亲和提纯的MLCK抗体微注射至血管平滑肌细胞内4小时后，经FITC结合的TUNEL染色和形态学观察证实的细胞凋亡。因此继发于抑制MLCK的肌球蛋白去磷酸化足以诱导细胞凋亡。三、细胞凋亡过程中肌球蛋白轻链磷酸化水平变化及在凋亡过程中作用以actinomycin D处理细胞的时相曲线显示肌球蛋白磷酸化水平表现为起始阶段的升高，随后下降。肌球蛋白磷酸化水平起始阶段的升高与凋亡早期细胞膜形成泡状物相关联。因此凋亡过程中肌球蛋白磷酸化分为两阶段：起始阶段肌球蛋白磷酸化与细胞膜泡状物相关，第二阶段为肌球蛋白去磷酸化与caspase激活及细胞凋亡相关联。四、ML-7诱导的细胞凋亡与凋亡信号转导 以Western Blot 检测 ML-7、CytochalasinD处理的平滑肌细胞及 Polyhema包被培养盘中细胞诱导 Anoikis的平滑肌细胞Bcl-2表达水平，结果表明经以上三种处理的平滑肌细胞Bcl-2表达水平均下降。纤维结合素包被玻片上的SMC及MCF-7细胞经ML-7及CytochalasinD 于相应时间点处理及对照组细胞行免疫细胞化学染色。结果表明未处理及ML-7处<WP=129>理3小时细胞线粒体中无Bmf，而ML-7处理后5小时Bmf 清楚地出现于线粒体中，同样CytochalasinD 处理后5 小时细胞亦见到Bmf 转位(translocation) 于线粒体中。 生物化学的方法进一步证实ML-7诱导的细胞凋亡过程中Bmf 由细胞支架转位至线粒体。ML-7处理及对照组平滑肌细胞，由细胞浆/线粒体试剂盒分离后行Western blot。结果显示：正常细胞Bmf只存在于细胞浆中，线粒体中无Bmf。而ML-7处理组细胞浆中Bmf 低于正常细胞，处理组线粒体中出现Bmf。免疫共沉淀法结果证实，对照组未见到Bcl-2 与Bmf 的colocalization。而 ML-7处理标本可见到Bcl-2 与Bmf 的colocalization。由以上结果可见促凋亡因子Bmf 在正常细胞存在于细胞浆，ML-7 及 CytochalasinD 等凋亡诱导剂导致Bmf 释放，转位于线粒体，并与位于线粒体的Bcl-2 结合使Bcl-2失去活性，从而触发细胞凋亡。Bcl-2基因转染可使Bcl-2高表达的平滑肌细胞免于ML-7诱导的细胞凋亡。Actinomycin D处理3T3细胞Caspase激活时相关系表明，Actinomycin D 处理8小时后Caspase激活。应用广谱Caspase抑制剂z-VAD-fmk使ML-7诱导的细胞免于凋亡。因此Caspase参与MLCK抑制剂ML-7诱导的细胞凋亡。五、MLCK抑制剂ML-7在体内诱导肿瘤细胞凋亡。MMTV C3H/HeN 小鼠接种Mm5MT乳腺癌细胞后，ML-7用药组肿瘤体积及重量均明显小于对照组。肿瘤组织TUNEL染色结果表明，ML-7用药组TUNEL细胞阳性率明显高于对照组。六、MLCK抑制剂ML-7与一些抗肿瘤药物抗肿瘤相加作用 在Mat-ly-lu及Mm5MT细胞系分别用5??、10????L-7处理2小时后合用100??竹叶乙甙 诱导凋亡细胞百分比与单用1000??竹叶乙甙诱导凋亡细胞百分比相近。在Mat-ly-lu细胞系5?????L-7与?nM泰素合用与300nM泰素单用<WP=130>诱导凋亡细胞百分比相近。在同基因前列腺癌荷瘤大鼠及同基因荷瘤小鼠?L-7及竹叶乙甙联合用药组肿瘤抑制率明显高于?L-7单药组及竹叶乙甙单药组。