土传病害是一类重要的植物病害。该类病害以土壤为媒介,病原菌可通过耕地、灌溉水或其他农事操作活动进行扩散传播。故一旦发病,蔓延快,危害严重。80 年代,随着种植制度和产业结构的调整以及社会经济交流的不断扩大,土传病害日趋严重,其中病原真菌尖镰孢萎焉专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)引起的枯萎病,大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄萎病及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的根腐病等尤为严重。选育抗病品种因其周期太长,抗性单一,遗传性状不稳定等因素远不能满足生产的需要;大量使用化学农药造成环境污染,威胁着人畜健康,同时造成病原菌抗性不断上升。因此各国将研究的焦点集中于土传病害的生物防治,尤其是利用分子生物学技术和方法对生防菌株进行遗传改良,以获得高效转基因菌株,使其生防潜力发挥至最大。 β-1,3-葡聚糖酶是一种重要的 PR 蛋白,它能够降解β-1,3-葡聚糖(大多数病原真菌细胞壁的主要成分之一),从而使细胞内含物外溢,导致病原菌死亡。体外抑菌试验表明:该酶具有抗菌功效,它不但能够抑制真菌菌丝的生长,而且还可以释放真菌细胞壁的诱导物,从而间接促进寄主体内植保素的积累,增加抗病能力。同时β-1,3-葡聚糖在植物细胞壁含量极少,因此该酶在植物抗病工程中具有极高的生防价值。 本研究对一株高产β-1,3-葡聚糖酶的链霉菌株,其酶的分离纯化、酶特性以及抗菌活性进行了系统的研究,旨在为土传病害的生物防治奠定理论基础。其结果如下: 1. 自泰安郊区大白菜植株根际土壤,利用诱导法-茯苓粉琼脂培养基的透明圈试验,分离筛选到 37 株产β-1,3-葡聚糖酶的菌株,细菌 18株,真菌 7 株,放线菌 12 株。其中,4 株链霉菌菌株 R8,R15,R31和 AS产生的透明圈较大,澄清度较高且持续时间较长。而 R15 是一株高产β-1,3- 葡 聚 糖 酶 的 链 霉 菌 株 , 初 步 鉴 定 为 金 色 链 霉 菌(Streptomyces aureo chromogenes)。 2. 在 ABP 培养液中诱导培养,离心即获得粗酶液,测定其分解β 1<WP=8>β-1,3-葡聚糖酶的纯化、特性及其抗菌活性-1,3-葡聚糖的酶活力。第 11d 酶活性最高,为最佳产酶时间。粗酶液经10%-75%的硫酸铵分级沉淀、羟基磷灰石(HA)柱层析、纤维素 DEAE-52 柱层析等步骤获得凝胶电泳均一的β-1,3-葡聚糖酶,纯化倍数为13.98,回收率达 4.031%。经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测的该酶的分子量为 41.3KDa。 3. 酶特性研究表明,该酶作用的最适温度为 55℃,45-60℃范围内酶活力较高,相对酶活在 70%以上。最适 pH 为 5.0,pH4.5-6.0 的范围内酶活较高,相对酶活力高于。该酶的热稳定性为 55℃,温度至 65℃时,酶基本失活,酶活损失率达 90.3%。在 pH 低于 7.5 时,该酶相对稳定,酶活力为 85%以上。当 pH 达到 8 时,残余酶活力仍达 55.97% 。金属离子 Fe3+,K+,Cu2+,Hg2+对酶有抑制作用,而 Ca2+,Fe2+,Ba2+,Mn2+,Al3+及 Zn2+对酶有激活作用。 4. 抑菌圈试验表明,该酶对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis),小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana),菜豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.phaseoli)以及腐霉菌(Phthium spp.)都有一定的抑制作用。其中对小麦纹枯病菌抑制作用最强,抑菌圈宽度达 15mm。盆栽防病试验结果表明,小麦种子经酶液处理后,病根率为 34.51%,防病效果为 64.28%。