绵羊FGF5基因的克隆、表达及RNA干扰研究

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养羊业是我国畜牧业的传统产业,其中羊毛是重要的纺织原料,是养羊业中附加值较高的产品,对羊毛进行长度改变的研究是改善羊毛品质和提高羊毛产量的重要手段。   羊毛的生长发育主要是由细胞内遗传因子控制的,其品质与产量主要是绵羊毛囊性状所决定,毛囊发育过程中基因和蛋白表达的调控在很大程度上决定着羊毛的品质和产量,同品种不同个体之间的产毛量与羊毛品质具有明显的差别,即使同一个体不同部位之间的产毛量与羊毛品质也存在很大的差异,这种差异与基因的差异表达有一定的内在联系。绵羊毛囊的发育是从合成特异性mRNA和蛋白质开始的,根本的原因是核内基因的启动,基因的选择表达,决定着毛囊的发育,利用与绵羊毛囊发育相关的基因,控制羊毛性状的表达,最终可以改变羊毛原有的长度。因此研究与毛囊发育相关基因的表达,对调控羊毛性状具有重要的意义。成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5,FGF5)是调节毛发长度的重要调控因子,已经成为人们改善毛发长度的研究重点。本研究通过PCR技术扩增绵羊FGF5基因CDS序列,利用生物信息学分析其编码的蛋白信息和结构特征;并进行组织特异性表达和原核表达及RNA干扰实验研究。从而为阐明绵羊FGF5的功能尤其是在羊毛生长发育中的作用提供了理论和实验基础。   根据牛的FGF5基因cDNA保守区序列设计引物对绵羊FGF5基因cDNA进行扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与牛的FGF5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片段为绵羊FGF5基因片段。利用生物信息学分析程序和软件,分析、预测FGF5蛋白的理化性质、可溶性、翻译后修饰位点、亲(疏)水性、跨膜区、信号肽序列、蛋白细胞定位区域、二级结构、抗原表位等,结果显示该蛋白属于可溶性和分泌型蛋白,具有免疫原性;与其他六种高等哺乳动物的序列同源性比较显示,绵羊FGF5基因CDS序列与牛、人、小鼠、大鼠、犬和猫的对应序列同源性高度保守,预测氨基酸序列同源性同样具有高度保守性。   采用RT-PCR方法,对绵羊皮肤、小肠、肾脏、心脏、肝脏、脾脏、胰脏和肺进行了FGF5表达检测,显示皮肤组织中FGF5表达明显高于其它实验组织,证实FGF5基因在皮肤中的表达,对毛发的生长发育起着重要的调节作用,是调节毛发生长的重要基因。   构建该基因的原核表达载体,通过IPTG诱导其在大肠杆菌中融合表达,获得一条55KDa的蛋白条带;菌液进行超声处理后,SDS-PAGE检测,发现沉淀在55 kDa处有条带,上清的相应位置没有条带,证明表达蛋白以包涵体的形式存在。   根据获得的FGF5基因CDS序列设计RNA干扰片段,构建具有干扰FGF5基因的RNAi载体,并通过绵羊成纤维细胞转染实验,筛选和鉴定含有目的基因的阳性细胞,最后通过荧光定量检测RNAi干扰FGF5基因在细胞内的蛋白表达水平。结果显示我们设计的干扰绵羊FGF5 mRNA的3个不同区域中,Ⅰ、Ⅱ和III干扰载体转染到细胞后,FGF5的表达量均显著下降,其中,Ⅰ和III干扰载体干扰效果极为显著,表明外源性H1启动子能够使siRNA干扰载体发挥作用。   综上所述,绵羊FGF5基因的CDS序列为一段长813bp的序列,具有高度的保守性,为一段完整的开放阅读框;其编码的蛋白是可溶性和分泌型蛋白,具有免疫原性,可以用来制备多克隆抗体;FGF5基因在皮肤中的高度表达,对毛发的生长发育起着重要的调节作用,推测该基因是调节毛发生长的重要基因;对绵羊成纤维细胞的RNAi试验,提示我们可以通过基因敲除手段实现绵羊毛长度的改变,以期获得具有优良羊毛品质的绵羊新品种。
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