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本实验室发现一株真菌菌丝的代谢产物具有抗病毒活性，用硅胶柱层析和制备型高效液相色谱得到了具有抗病毒活性的纯品，命名为JN219。JN219极性较强，在220nm有最大的紫外吸收峰，质谱(ESI)测得该化合物分子量为519道尔顿。体外抗病毒活性跟踪发现JN219具有抗轮状病毒(RV)活性，在μg-ng/ml水平可使1000个TCID50/ml的HCMV、VSV、RV完全丧失感染活力；体内疗效模型研究发现，JN219可以缓解RV(SA11株)感染引起的乳鼠腹泻。初步表明JN219不仅仅在体外有显著抑毒效果，而且体内效果显著。明确抗病毒机制是药物应用临床的先决条件之一。为研究JN219的抗RV机制，本研究小组进行了初步的探索，发现JN219可能是作用于病毒复制周期最初黏附.融合.穿入阶段，通过阻止病毒进入宿主细胞实现抗病毒作用，那么JN219在RV穿入细胞过程中，如何阻断病毒穿入发挥抗病毒效果的?本研究采用原核载体克隆表达轮状病毒外壳蛋白VP4及其亚单位VP5*、VP8*，用体外细胞培养病毒感染模型竞争抑制试验建立抗RV机理研究模型，为探讨JN219抑制RV穿入宿主细胞的分子靶位、明确JN219抑制病毒穿入宿主细胞机理奠定基础。
目的：建立研究JN219阻止RV穿入细胞的研究模型，为探讨JN219抑制RV穿入机理奠定基础。
方法：
1.RV膜蛋白VP4、VP5*、VP8*的克隆表达和纯化
(1)构建pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*表达载体
在GeneBank查得RVVP4全基因序列，以RV之细胞培养物作为模板用RT-PCR方法扩增目的基因，与pET30a载体连接后转化BL21(plysS)，用PCR、酶切方法鉴定后挑选阳性菌落委托测序。
(2)诱导表达、纯化目的蛋白
将阳性菌落扩增、提取质粒转化BL21(plysS)菌株，用IPTG诱导、SDS-PAGE方法检追踪研究表达条件、用镍柱层析纯化目的蛋白(6×his标签)。用标签抗体-Westernblot方法进行鉴定。
2.JN219抑制RV穿入过程研究模型的建立
(1)纯化蛋白毒性研究
将VP4、VP5*、VP8*梯度稀释后接种MA104细胞，与细胞对照比较，通过细胞病变观察重组蛋白的细胞毒性。
(2)JN219抑制RV细胞穿入现象的确定
a)病毒接种细胞1h，病毒完成穿入过程后接种JN219到多孔板细胞上，根据细胞病变判断JN219作用效果。若不出现病毒病变，可表明JN219具有抑制病毒基因转录复制的作用。
b)将JN219与病毒作用1h后接种于细胞，根据细胞病变判断JN219抗病毒活性；若不出现病毒病变，说明JN219在病毒穿入细胞前发挥抗病毒作用，抑制了病毒的穿入过程。
c)将紫外线灭活的病毒与JN219作用后，将混合液与病毒作用1h接种细胞，观察灭活的病毒是否竞争了JN219的抗病毒穿入位点，来探讨JN219是否通过作用于病毒外壳融合蛋白而实现抑制病毒的机制。
(3)JN219阻止RV穿入过程分子机制研究模型的建立(竞争结合试验)
上述试验发现，JN219作用于病毒复制周期最初黏附-融合-穿入阶段，通过阻止病毒进入宿主细胞实现抗病毒作用。如果将JN219与VP4、VP5*、VP8*作用(与JN219的抗病毒穿入位点结合)，则JN219在后续的抗病毒试验过程中可能丧失抗病毒活性，通过该模型，可明确JN219抑制RV穿入过程的分子靶位。
结果：
1.RV膜蛋白VP4、VP5*、VP8*的克隆表达和纯化
(1)构建pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*表达载体
经PCR和酶切鉴定证实构建的pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*质粒目的基因分子量与预测分子量均一致，通过GeneBank序列比对，pET30a(+)VP4质粒前780bp处有5个碱基发生突变，后870bp处有2个碱基发生突变，经蛋白分析软件分析认为不影响其功能。
(2)诱导表达、纯化目的蛋白
pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*的BL21(plysS)菌株用IPTG诱导、经His-镍柱层析纯化了目的蛋白，VP4、VP5*、VP8*三个蛋白的纯度均达到90％，VP4为0.24μg/ml、VP5*为0.8μg/ml、VP8*为0.5μg/ml。它们均与标签抗体发生反应(Westernblot)。
2.JN219抑制RV穿入过程研究模型的建立
(1)纯化蛋白毒性研究：将VP4、VP5*、VP8*梯度稀释后接种MA104细胞，与细胞对照比较，未发现细胞病变发生。
(2)JN219抑制RV细胞穿入现象的确定
a)病毒接种细胞1h、病毒完成穿入过程后用JN219攻击，与病毒对照组相比实验组细胞病变率低，表明JN219对病毒基因复制转录表达有抑制作用。
b)将JN219与病毒作用1h后接种细胞，结果发现实验组细胞形态基本正常，表明病毒感染过程被抑制，且JN219作用机制与病毒黏附、穿入过程相关。
c)JN219与紫外灭活病毒充分作用后，再与RV作用，结果发现细胞出现RV病变，表明JN219的抗病毒活性被紫外灭活的病毒消耗，提示JN219可能是与病毒外壳上某种功能蛋白发生作用，干扰了病毒穿入过程。
(3)JN219阻止RV穿入过程分子机制研究模型的建立(竞争结合试验)试验
设计将JN219与VP4、VP5*、VP8*作用，通过JN219在后续的抗病毒试验过程中的细胞病变程度，判断JN219抑制RV活性是否VP4、VP5*、VP8*所阻断，经过实验初步明确JN219与VP4结合是其抗RV穿入机制之一。功能亚单位VP5*、VP8*是否是JN219作用位点有待后续研究确定。
结论：
1.采用原核细胞表达系统，获得了RV外壳蛋白VP4及其酶切片段VP5*、VP8*，VP4、VP5*、VP8*纯度在90％左右。
2.建立病毒感染模型，初步确定JN219与VP4结合后，其抗RV活性下降。