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研究背景和目的 贲门失弛缓症是一种食管动力障碍性疾病，其特征是吞咽时平滑肌为主的下段食管缺乏蠕动和下食管括约肌(LES)松弛障碍以及LES静息压力升高。主要症状是对液体和／或固体食物的吞咽困难。研究表明，贲门失弛缓症患者支配LES的一氧化氮合酶(NOS)神经缺失，胆碱能神经保存完整，LES肌肉本身的舒缩功能正常。因此，抑制性神经递质一氧化氮(NO)的合成障碍是导致LES不能松弛的根本原因。目前的治疗包括药物、扩张、BT注射和手术等，均属姑息性治疗，各有局限性。基于以上的理论，本实验旨在将NOS基因借助腺病毒载体导入LES平滑肌细胞内，使之在平滑肌内合成NO，松弛LES，达到治疗贲门失弛缓症的目的，为临床治疗贲门失弛缓症提供新的方法和思路。 实验方法 1 eNOS复制缺陷重组腺病毒的构建 4.1kb的目的基因eNOS cDNA片段从eNOS-pcDNA3质粒中酶切得到，定向克隆构建转移质粒pAdTrack-CMV-eNOS，经Pme Ⅰ线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183，利用细菌内的同源重组机制构建重组腺病毒质粒pAd-eNOS。pad-eNOS经Pac Ⅰ线性化后转染293细胞包装成病毒颗粒Ad-eNOS，反复感染293细胞扩增病毒，获得高滴度的病毒上清。用同样的方法构建对照病毒Ad-GFP(仅表达GFP)。PCR检测重组病毒中是否携带目的基因，以及扩增后的病毒库是否污染了具备复制能力的野生型腺病毒。 2 eNOS在LES平滑肌细胞中的体外表达 取家猫LES组织，分离平滑肌后胶原酶消化成单个平滑肌细胞，用15％小牛血清的高糖DMEM(12mmol/L)培养，并通过免疫组织化学染色及电镜观察进行鉴定。分别用Ad-eNOS及Ad-CMV感染体外培养的LES平滑肌细胞，采用Western blot、RT-PCR及免疫组织化学染色技术检测eNOS在平滑肌细胞中的表达，并测定基因表达产物eNOS活性以及NO含量。第二军医大学博士学位论文中文摘要3猫责门失弛缓症动物模型制备家猫28只，随机分为两组，实验组(BAC组)20只，对照组(NS组)8只。胃镜下将2 nil 4 nuno比节基二甲基十四烷氯化馁(Benzyldimethyltetradeeylammonium ehioride，B^C)环周注射到BAe组猫LES内，NS组注射生理盐水Znil。8周后测定LES的压力和松弛功能。食管吞钡造影观察钡剂在食管内储留情况，并观察摄食及体重的变化。观察两组动物LES分别在在体和离体两种情况下对一氧化氮合酶(NOS)的底物L一精氨酸(L一Axg)、NOS抑制剂硝基一L一精氨酸甲基酷(L一AME)、NO的供体硝普钠 (SNP)等药物的反应，并观察离体LES肌条对电场刺激的反应。免疫组织化学染色分析BAC处理对LES中NOS阳性神经元分布的影响。4 eNOS基因转移对猫责门失弛缓症的治疗效果观察将18只猫贵门失弛缓症动物模型随机分为治疗组(eNOS组，n=10)与对照组(GFP组，n=8)，并将6只健康猫设为空白对照组(NS组，二6)。在eNOS组动物LES内注射lml10，’pfu/L的Ad一eNoS，GFP组动物注射lml 10，2 pfu几的^d一GFP，Ns组注射lml病毒贮存液。分别在注射后3天、1周、2周、3周、4周时测定3组动物LES静息压力和LES的松弛功能，并在各时间点采用Westem blot、RT一PCR及免疫组织化学染色技术检测eNOS在LES中的表达，测定基因表达产物eNOS活性以及LES组织中NO含量，并观察L一Aig、L一AME、sNP等药物对LES静息压力和离体肌条张力的影响以及肌条对电场刺激的反应。5统计学处理实验数据以均数士标准差(X士s)表示，感染前后自身对照采用配对t检验，感染以后多个处理组间采用F检验进行统计学处理，尸<0.05为显著性差异。实验结果1重组复制缺陷腺病毒载体Ad一eN0s的构建成功构建了转移质粒pAdTrack-CMV一eNOS以及重组腺病毒质粒pAd-eNOS和pAd一GFP，分别经酶切鉴定正确。2种重组病毒质粒转染293细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP表达，证明两种病毒质粒己分别被包装成复制缺陷腺病毒Ad一eNOS和Ad一GFP。病毒扩增后测得^d一喇05和^d一oFP病毒滴度分别为6 X 10”pfi刀L、4 X 10，Zpfu/L。PCR结果表明重组复制缺陷腺病毒Ad一eNOS中携带eNOS基因，扩增的病毒库中无具备复制能力的野生型腺病毒污染。第二军医大学博士学位论文中文摘要2猫LES细胞的体外培养及eNOS基因的体外表达体外培养的猫LES细胞经抗Q一actin免疫细胞化学染色和电镜观察证实为平滑肌细胞。两种病毒分别感染培养的平滑肌细胞后，RT.PCR及Westem blot结果证实，Ad一eNOS感染组有eNOS的高效表达，而Ad一GFP感染组无表达。细胞爬片免疫组织化学染色提示Ad一eNOS感染的细胞在胞核及胞浆中均有棕褐色物质，对照组为阴性。Ad-eNOS感染组NOS活性(5.59士0.78U/m 1 vs 0.96士0.14U/ml，P<0.01)及NO含量(875.5士43.6 p mol/L vs 102.5士35.2协mol几，夕<0.01)均明显高于Ad-GFP感染组。3猫责门失弛缓症动物模型的制备8周时BAC组出现摄食减少，体重减轻，有明显的食管钡剂漪留，对照组食管钡剂通过顺利。BAC组LES压力较实验前明显升高(38.6士6.4 nunHg vs 21 .3士4.1 nunHg，P<0.05)，而对照组实验前后LEs压力无明显变化(22.5士5.3 nunHg vs 23.