论文部分内容阅读
葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)专性寄生于葡萄根系和叶片,历史上曾对欧洲葡萄造成了毁灭性为害。目前生产上主要通过使用抗性砧木嫁接防治根瘤蚜,但我们对葡萄砧木抗根瘤蚜侵害的分子机理还知之甚少。植物WRKY转录因子是植物界数量最多的转录因子家族之一,本论文以敏感品种克瑞森和抗性砧木1103Paulsen为试材,探究了葡萄WRKYs对根瘤蚜侵害的应答反应,主要研究结果如下。1、葡萄(Vitis vinifera L.)中共发现63个WRKY转录因子基因。根据拟南芥WRKY转录因子的分类原则,除VvWRKY32-2外其它共分成3大类和7个亚类,63个葡萄WRKY基因不均匀地分布在除第3号染色体外的其它18条染色体和一条未知染色体上,亚细胞定位预测软件分析表明绝大多数葡萄WRKY定位于细胞核。外显子及蛋白长度分析表明序列缺失参与WRKY进化,而基因组复制促进了WRKY家族成员扩增。在发育的葡萄果实各组织(果皮、果肉和种子)中,葡萄WRKY基因表现出不同的表达丰度,还有一些基因表达存在明显的时空特异性。2、WRKY基因响应葡萄-根瘤蚜之间的互作反应。根瘤蚜侵染导致敏感品种克瑞森30多个WRKY基因的表达量发生变化,多数基因的表达量上调,仅Vv WRKY20、24、42、49和51-2表达量显著下调。抗性砧木1103 Paulsen(V.Berlandieri×V.Rupetris)WRKY基因表达量变化与克瑞森基本一致,但VvWRKY2-2和VvWRKY42在1103Paulsen中的表达模式与克瑞森相反,这可能是决定不同基因型葡萄对根瘤蚜抗性的关键调节因子。根结形成时部分WRKY基因表现出不同的表达模式,与未侵染的对照相比根结中VvWRKY2和VvWRKY46表达量下调,而Vv WRKY51-1、VvWRKY53和Vv WRKY55表达量升高,表明WRKY基因正/负调节葡萄对根瘤蚜的防御反应。另外,WRKY基因在靠近根结未被侵害的根中也表现出与根结中类似的表达模式,说明根瘤蚜对葡萄WRKY基因的诱导是系统性的。3、我们同时检测了部分WRKY基因在敏感、中抗和免疫葡萄根系和叶片中的表达变化,结果发现葡萄根系和叶片中WRKY基因组成型表达量与其根瘤蚜抗性强弱无相关性,根瘤蚜侵害能够启动葡萄WRKY基因介导的诱导型防御反应。4、葡萄SA信号途径相关基因参与葡萄-根瘤蚜互作反应。根瘤蚜瞬时侵害抑制SA积累相关基因如VvPAD4和VvMATE的表达,使根系和叶片中总SA含量分别下降24%和58%,但同时诱导1103Paulsen根系中PRs基因表达量上调,如VvG1、VvCHI1B、VvCHI1B1和PR3。施用外源SA和Me-JA分别降低根瘤蚜若虫成活率50%和24%。推测PRs基因的上调与总SA的下降无关,是受到其它因子的调控。另外,VvCHI1B在1103P形成的根结中表达量上调了50倍,而在克瑞森的根结中表达量下调。5、拟南芥同源基因功能分析推测VvWRKY40-1和VvWRKY46参与葡萄SA信号途径,且与克瑞森相比这两个基因在1103Paulsen中持续响应根瘤蚜侵害。Race结果表明VvWRKY40-1和VvWRKY46的开放阅读框长度分别是954bp和1050bp,其编码的蛋白都定位于细胞核。瞬时表达和体外试验证明VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白能够与顺式作用元件Wbox(T)(T)TGAC(C/T)结合互作,启动下游基因表达。酵母单杂交和同源共转化试验发现VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白分别与VvCHI1B基因启动子互作,这表明WRKY蛋白能在转录水平直接调节PRs基因的表达参与葡萄对根瘤蚜防御反应。