论文部分内容阅读
乳糜泻(CD)是发生在遗传易感人群中的自身免疫性疾病,因摄入麸质蛋白而引起的慢性小肠炎症。乳糜泻的发病率在全世界人口中约为1%,目前唯一有效的治疗方法即是终生坚持无麸质饮食。但是完全避免麸质蛋白的摄入会严重影响乳糜泻患者的生活质量,因此筛选和培育低致乳糜泻毒性的小麦品种作为生产无麸质食品的原材料十分重要。目前用于低致乳糜泻毒性小麦品种筛选工作的方法较多,如何更为简便、准确的作出评价是筛查工作中的关键。因此本研究将基于4种表位定量方法和Caco-2细胞模型分别评价9种新疆小麦麸质蛋白的致乳糜泻毒性,分析比较不同测定方法之间的一致性和差异性,为后续乳糜泻相关研究方法的选择提供理论依据。本文主要的方法、结果和结论如下:1.采用免疫印迹法测定小麦麸质蛋白中致乳糜泻表位Glia-α9和Glia-α20的含量,结果显示新曙光1号中的Glia-α9和Glia-α20表位总含量最高,新春20的含量最低,其余品种表位含量由高到低依次为:04-引鉴105、吐春6号、98-14、墨巴66、阿春2号、01-25和兰麦。2.基于R5夹心ELISA评价不同品种新疆小麦致乳糜泻毒性,各小麦的麸质蛋白含量由高到低依次为:04-引鉴105(112,333 ppm)、新曙光1号(91,333ppm)、01-25(70,400 ppm)、墨巴66(57,680 ppm)/兰麦(56,107 ppm)、98-14(44,200ppm)、新春20(40,786 ppm)/吐春6号(40,653 ppm)/阿春2号(39,800 ppm)。3.通过高通量测序法对小麦RNA转录组进行分析,共推导出α-麦醇溶蛋白片段(UPFs)21个,丰度值介于0.27-35.32之间;9个小麦品种中的主要致乳糜泻表位及其变体表位频率(×100)由高到低依次为:墨巴66(321.48)、阿春2号(312.06)、吐春6号(310.98)、01-25(300.49)、兰麦(292.93)、新春20(283.13)、新曙光1号(279.89)、04-引鉴105(271.77)和98-14(257.86)。4.LC-MRM/MS法测定中,成功制备标肽标准曲线,并计算得到小麦麸质蛋白中致乳糜泻肽段含量,9个小麦品种中的肽段含量由高到低依次为:新曙光1号(19,145.51 ng)、01-25(14,699.60 ng)、新春20(12,855.20 ng)、兰麦(10,935.20ng)、98-14(10,837.70 ng)、阿春2号(7,131.97 ng)、墨巴66(6,019.50 ng)、04-引鉴105(5,779.55 ng)和吐春6号(5,002.95 ng)。5.上述四种检测方法中基于基因水平的高通量测序法与基于蛋白水平的其他3种方法的检测结果差异性大,而基于蛋白水平的检测方法结果一致性较好。6.成功构建Caco-2细胞单层模型,并发现麦醇溶蛋白经体外模拟胃肠道消化后,消化产物以1.5 mg/mL的终浓度作用细胞,会导致Caco-2细胞单层通透性增加,增加程度由高到低依次为:墨巴66、01-25、新春20、98-14/兰麦、阿春2号/新曙光1号、吐春6号以及04-引鉴105;与此同时,消化产物也可以刺激Caco-2细胞产生氧化应激,结果表明不同小麦醇溶蛋白消化产物使Caco-2细胞产生氧化应激水平由高到低依次为:新春20、01-25、新曙光1号、98-14、阿春2号、墨巴66、兰麦、吐春6号和04-引鉴105。