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由于高效抗逆转录病毒疗法在艾滋病治疗中的广泛使用,艾滋病患者的发病率和死亡率明显下降,但是耐药性的产生成为影响抗病毒治疗效果的主要因素。HIV耐药性检测包括基因型耐药检测和表型耐药检测,已应用于临床治疗,用以指导治疗方案的选择。因基因型耐药检测方法检测周期短和价格低而在临床上较常使用,但对于治疗史复杂的患者,则需要将基因型和表型耐药检测方法的结果结合起来分析,才可提供互补的信息。 在本研究的第一部分,为了评价本实验室自建的HIV-1耐药基因型检测in-house法的可重复性,从耐药数据库在2008年至2010年间已进行耐药检测的样品中选取204份重新进行检测,对两次的耐药结果进行一致性分析。研究结果表明,在204份样品中,两次检测结果对整体耐药发生的判断的一致率为98.5％(201/204),对每种抗病毒药物的耐药发生的判断的一致率为92.2％(188/204),其中有167份(占81.9％)样品的两次检测结果对每种药物的耐药程度判断完全一致。并且,对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)耐药的判断不一致要比蛋白酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)多。两次检测共有159个位点存在不一致的耐药突变形式,在蛋白酶区第71位和逆转录酶区第103位出现频率最高。 总之,HIV-1耐药基因型检测in-house方法具有可重复性,对群体耐药发生的判断具有良好的一致性,但在个别病例的耐药判断上也有不一致的情况。在方法学上尤其是对混合碱基的判读还需进一步标化。由于混合碱基的判读会直接影响耐药突变的确定,所以对检测人员的培训是非常重要的环节,检测人员需严格控制序列的质量,并且在序列拼接和清理过程中,严格按照混合碱基的判断标准进行操作,以确保获得高质量的序列分析结果。 在本研究的第二部分,为了构建一种新型的HIV-1耐药表型检测方法以及研究病毒的复制能力,首次将由单基因组扩增方法确定为单模板的第一轮扩增产物在体外通过克隆的方式装入pNL4-3-BstEII中,转染293T细胞以收获重组病毒。以TZM-bl细胞作为指示细胞,评价病毒对逆转录酶抑制剂的敏感性。本研究首先对pNL4-3-BstEII进行鉴定,与pNL4-3相比,TCID50虽有下降但也有很强的的感染活性,对AZT、3TC、DDI和NVP的敏感性相似,所以将pNL4-3-BstEII作为所构建的重组病毒的对照病毒。 将样品HENDRC593相应的第一轮扩增产物装入载体中,成功构建重组质粒25份,转染293T细胞后,筛选出14株具有较强感染活性的重组病毒。为评价患者体内不同准种的复制能力并观察L210W和T215Y对病毒适应性的影响,选取具有相同耐药突变的两个感染性克隆06HENDRC593_D_15_17和HENDRC593_D_15_4,将HIV-1逆转录酶区第210位氨基酸W回复为野生型L,并选取与06HENDRC593_D_15_17时间点相同的感染性克隆06HENDRC593_D_15_10,将第215位氨基酸Y回复为T。重复实验中AZT、3TC和DDI对6株重组病毒的IC50倍数改变差异94.4％(17/18)在3倍以内。 利用复制动力学方法进行病毒适应性的研究,发现患者在治疗45个月时体内准种06HENDRC593_D_15_17比06HENDRC593_D_15_10具有更好的复制能力。将T215Y这个耐药突变位点回复为野生型后,对AZT的敏感性明显增加,并且具有更好的复制动力学。AZT对携带L210W的重组病毒IC50倍数改变的中位数比不携带的重组病毒要高3.5倍,HENDRC593_D_15_4在RT区第210位氨基酸W回复突变为L后复制能力明显升高,而06HENDRC593_D_15_17在突变后复制能力有所下降。 总之,我们初步构建了一种基于重组病毒的表型检测方法,可以检测患者对逆转录酶抑制剂的表型耐药情况。而且将单基因组扩增的检测方法与本方法结合起来发现,患者体内不同准种的复制能力不同,代表病毒主要耐药突变形式的准种更具有复制适应性上的优势。对耐药突变T215Y和L210W的复制动力学的影响的研究结果表明,T215Y会导致病毒复制能力的下降,而耐药突变形式M41L/L210W/T215Y中L210W对病毒复制能力的影响可能需要结合病毒的遗传背景,如相关多态性位点E203K,来综合分析。