脑卒中(stroke)是位列世界人类死亡及致残原因第二位的常见病、多发病,而急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)是最常见的脑卒中类型,给家庭和社会带来了沉重的负担。AIS的发病是以血流以及梗死区葡萄糖和能量供应的突然中断为开端,继而导致严重的神经功能障碍。尽管随后的再灌注可以迅速恢复缺血脑组织的正常血供和功能,但也会引起继发性损伤,即缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)包括一系列的病理级联反应:兴奋性氨基酸(EAAs)毒性、钙内流、自由基积聚、炎症反应、血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏、脑水肿和细胞凋亡等。因此,寻找针对CIRI的防治方法一直是神经科学领域的重要任务。脑保护和损伤修复策略对于CIRI的防治具有重要意义。近年来,脑卒中的治疗技术和药物均不断地发展、进步,但针对CIRI有效的药物往往在临床转化的过程中遭遇失败。究其原因在于:其治疗的重心仅局限在单一的治疗靶点,忽略了不同治疗靶点之间的相互作用。因此,急需新的研究策略来预防和治疗CIRI。基于上述策略,学者们提出了神经血管单元(neurovascular unit,NVU)的概念。NVU可以看作是大脑的基本结构和功能单位,主要结构包括:神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞及其基膜、周细胞、小胶质细胞以及细胞外基质。NVU强调了上述细胞之间复杂的相互作用以及它们在大脑病理生理机制中的作用,因此,NVU已成为研究脑卒中多靶点、多水平联合治疗的重要模型。根据NVU的概念,本实验室利用原代培养的SD大鼠大脑皮质毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)、星形胶质细胞和神经元三种细胞共培养的方法,构建了一种体外NVU模型——SD大鼠重要大脑细胞网络模型;该模型能够用于大脑疾病的相关研究、潜在药物靶点的筛选以及治疗药物的开发。传统中草药以其多作用靶点、高安全性的特点,在治疗CIRI方面展现出得天独厚的优势。丹参是一种广泛应用于各种心脑血管疾病以及神经退行性疾病治疗的传统中草药,隐丹参酮(cryptotanshinone,CTs)则是从丹参根部提取出的一种重要的丹参酮,它是一种脂溶性的小分子,易于通过BBB。现代药理学研究表明,CTs不但具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗凋亡、抗糖尿病及减肥的作用,还具有防治缺血性疾病、动脉粥样硬化及Alzheimer’s病的作用。近年来,也有学者关注到CTs与I/R损伤之间的关系。已有研究者证实,CTs具有保护心肌I/R损伤和肝I/R损伤的作用;然而CTs对CIRI(特别是在细胞水平)的保护作用及其机制尚未阐明。明确CTs对CIRI的神经保护作用可以为脑保护机制的研究以及药物的筛选提供新的思路。氧糖剥夺/复氧糖(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)是一种常用的、体外模拟CIRI的方法,其病理改变与在体CIRI时脑细胞和BBB的病理改变基本相似。故而,本课题中,我们利用OGD/R损伤的SD大鼠重要大脑细胞网络模型,观察CTs对SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤的干预作用,并对其可能的干预机制进行深入探讨。第一部分SD大鼠重要大脑细胞网络模型氧糖剥夺/复氧糖损伤模型的建立目的:选择适宜的OGD/R处理条件,在细胞水平建立一种可靠的、简便易行的体外NVU的氧糖剥夺/复氧糖(OGD/R)模型,为研究CTs对CIRI的干预作用及其机制的探讨奠定基础。方法:利用体外原代细胞培养技术,提取、培养SD大鼠大脑皮质BMECs、星形胶质细胞和神经元,并进行纯度鉴定;利用transwell insert将上述三种细胞共培养,在体外构建SD大鼠重要大脑细胞网络模型;设立正常对照组和OGD/R组,每组又分设R 0h、0.5h、3h、6h、12h、24h和72h共7个不同复氧糖时间组,各设两个复孔,OGD/R组采用OGD 2h后复氧糖处理;应用试剂盒检测模型中细胞培养液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性和三种细胞的细胞活力;应用ERS-2 System电阻仪,检测SD大鼠重要大脑细胞网络模型TEER值。结果:1.BMECs原代培养7 d后成熟,经血管内皮相关因子VIII抗体免疫荧光染色鉴定,细胞纯度>95%。2.星形胶质细胞原代培养10 d后传代,第二代培养9 d成熟,经GFAP免疫荧光染色鉴定,细胞纯度>90%。3.神经元原代培养7 d后成熟,经MAP2免疫荧光染色鉴定,细胞纯度>90%。4.利用transwell insert将BMECs、星形胶质细胞和神经元共培养,共培养的第3 d到第5 d,TEER值趋于稳定(P>0.05)。5.SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD 2h处理后,开始复氧糖(R)处理:(1)R3h时:神经元的细胞活力开始下降(P<0.01),且R 24h和R 72h时较R 3h时下降得更显著(P均<0.01)。(2)R 6h时:BMECs和星形胶质细胞的存活率才开始下降(P均<0.05),且R 24h和R 72h时较R 6h时下降得更显著(P均<0.01);细胞培养液LDH活性开始增加(P<0.01),且R 24h和R 72h时较R 6h时增加得更显著(P均<0.01);TEER值开始下降(P<0.05),且R 12h、R 24h和R 72h时较R 6h时下降得更为显著(P分别为<0.05,<0.01和<0.01)。结论:1.SD大鼠重要大脑细胞网络模型经OGD 2h/R 24h处理后,被成功地构建为OGD/R损伤模型。2.TEER值的降低可作为判断SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤模型成功构建的检测指标。第二部分隐丹参酮对SD大鼠重要大脑细胞网络模型氧糖剥夺/复氧糖损伤的干预作用目的:观察CTs对SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤的干预作用,验证CTs对CIRI的神经保护作用。方法:(1)利用成功构建的SD大鼠重要大脑细胞网络模型,将0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、50和100μM共9种不同浓度CTs作用于模型24 h后,用CCK-8的方法,检测模型中神经元的毒性,选择适宜的CTs浓度。(2)利用SD大鼠重要大脑细胞网络模型,设立预处理给药组和即刻给药组,每个组再分设正常对照组和各适宜CTs浓度组,各设3个复孔,除正常对照组之外均采用OGD2h/R 24h处理;应用LDH检测试剂盒,检测OGD/R损伤后的细胞损伤程度,确定最佳给药方式和有效剂量。(3)利用SD大鼠重要大脑细胞网络模型,设立正常对照组、OGD2h/R 24h组、CTs 2.5μM组和CTs 5.0μM组,各设3个复孔,除正常对照组之外均采用OGD2h/R 24h处理;倒置显微镜下观察模型中三种细胞的细胞形态;应用检测试剂盒,检测模型中三种细胞的细胞活力及细胞损伤程度的干预作用。结果:1.不同浓度的CTs作用于SD大鼠重要大脑细胞网络模型24 h后,0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10μM CTs对神经元细胞活力无明显影响(P>0.05)。2.预处理给药组中,与OGD2h/R24h组相比,CTs1.0、2.5、5.0和10μM组LDH活性均明显降低(P分别为<0.05,0.01,0.01和0.05)。即刻给药组中,与OGD2h/R24h组相比,各CTs组LDH活性无明显差异(P均>0.05)。3.无论是CTs 2.5μM组还是CTs 5.0μM组均可修复OGD/R损伤所造成的BMECs、星形胶质细胞和神经元的各种病理性形态学改变,明显提高三种细胞的细胞活力(P均<0.01),降低细胞培养液LDH活性(P分别为<0.05和<0.01)。结论:1.CTs对SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤的最佳给药方式为预处理给药,有效剂量为2.5和5.0μM。2.CTs预处理能够恢复OGD/R损伤引起的细胞收缩,减少细胞脱落,提高细胞活力,减少细胞损伤,对SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤具有保护作用。第三部分隐丹参酮对SD大鼠重要大脑细胞网络模型氧糖剥夺/复氧糖损伤的干预作用机制目的:探讨CTs对SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤的干预作用机制,为脑保护机制的研究以及药物的筛选提供新的思路。方法:利用SD大鼠重要大脑细胞网络模型,设立正常对照组、OGD2h/R 24h组、CTs 2.5μM组和CTs 5.0μM组,各设3个复孔,除正常对照组之外均采用OGD2h/R 24h处理;应用检测试剂盒,检测神经元内ROS含量以及细胞培养液中MDA含量、SOD活力和NO含量;应用ELISA法,检测细胞培养液中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量;应用TUNEL法,检测神经元的细胞凋亡率;应用ERS-2 System电阻仪,检测TEER值;应用荧光化学发光检测仪,检测BMECs对Na F的通透量;应用Western blot法,检测CTs对OGD/R损伤后神经元的Caspase-3、cleaved-Caspase-3、PARP、cleaved-PARP、Bax、Bcl-2和MAPKs表达以及BMECs的ZO-1、Occludin、Claudin-5、MMP-2和MMP-9表达的影响。结果:1.CTs预处理可使SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤后神经元内的ROS水平、细胞培养液中的MDA和NO水平降低(P均<0.01),而使细胞培养液中的SOD活力增高(P<0.01)。2.CTs预处理可使SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤后细胞培养液中的促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平降低(P均<0.01)。3.CTs预处理可使SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤后神经元细胞凋亡率降低(P<0.01),cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP的表达降低(P均<0.01)。4.CTs预处理可使SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤后神经元Bcl-2的表达增加、Bax的表达降低(P均<0.01),从而使Bcl-2/Bax比值增大;5.CTs预处理可使SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤后神经元p-JNK和p-p38 MAPK的表达降低(P均<0.01)。6.CTs预处理可使SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤后TEER值增高(P<0.01),BMECs对Na F的通透量降低(P<0.01);BMECs中ZO-1、Occludin和Claudin-5表达增加,而MMP-9表达降低(P均<0.01)。结论:1.CTs对SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤的干预作用与抗氧化、抗炎、抗神经元凋亡以及改善BBB功能的机制有关。2.CTs抑制SD大鼠重要大脑细胞网络模型中OGD/R损伤神经元凋亡的机制可能与上调Bcl-2/Bax表达以及抑制JNK和p38 MAPK信号通路相关。3.CTs改善SD大鼠重要大脑细胞网络模型OGD/R损伤时BBB的屏障功能的机制可能与上调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达以及抑制MMP-9表达而减少细胞外基质的降解相关。