霉菌毒素是真菌分泌的具有剧毒的代谢产物,普遍分布在土壤中,很容易污染作物与食物,曲霉毒素中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)污染面最广泛,常常能在天然食品中被检测到,因此对其毒性的研究备受重视。研究表明,肝脏作为黄曲霉毒素的靶器官,在低剂量的AFB1作用下就能够造成肝脏功能的严重损伤。目前对于AFB1诱导细胞自噬发生的研究主要集中在免疫细胞以及肉鸡的肝脏中,关于AFB1影响人肝细胞自噬及其发生机制的研究尚未见。本文意在使用人肝细胞HepG2细胞,研究AFB1对其自噬水平及其自噬流的影响。在研究过程中发现,AFB1导致HepG2细胞内自噬小体增加,并在自噬流后期发生了阻断。由于溶酶体在自噬小体降解过程中发挥着重要的作用,为探讨AFB1引发自噬流后期阻断的原因,我们深入研究了AFB1对溶酶体造成的损伤,进而揭示AFB1阻断HepG2细胞自噬流的具体机制。最后我们检测了AFB1对HepG2细胞凋亡的影响,并分析了AFB1诱导的细胞凋亡与溶酶体损伤的关系。本文为AFB1引发肝细胞损伤机制的研究提供了新思路,对AFB1的危害评估和危险防御具有重要的价值与意义。主要研究内容与结果如下:(1)AFB1暴露对HepG2细胞自噬的影响。首先通过MTT实验筛选出AFB1对HepG2细胞不具有毒性作用的实验条件;在不同处理时间和浓度的AFB1作用下,使用Western Blot对自噬标记性蛋白LC3-Ⅱ的表达量进行评估,最终筛选出20μM AFB1处理6h作为后续自噬研究的处理条件;MDC染色实验结果表明,经AFB1处理后细胞内自噬小体荧光染色增强;在透射电镜下观察AFB1处理后细胞内自噬小体增多,分别从分子和细胞形态学两个方面证明AFB1引起了HepG2细胞内自噬小体的增多。随后引入氯喹(Chloroquine,CQ)和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)两种自噬抑制剂,来进一步研究AFB1对自噬流的影响。通过Western Blot测定自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达量变化,AFB1能够引起LC3-Ⅱ和P62蛋白表达升高,且与自噬后期抑制剂CQ作用相似;通过激光共聚焦显微镜观察mRFP-GFP-LC3腺病毒转染后荧光表达情况,结果表明AFB1处理后细胞内GFP荧光未发生猝灭,以上实验共同证实AFB1引起自噬流后期阻断。(2)AFB1暴露对溶酶体膜通透化的影响。为进一步研究AFB1诱导HepG2细胞自噬流后期阻断的机制,我们进行了以下研究。通过免疫荧光染色发现,溶酶体标记蛋白LAMP1与自噬小体标记性蛋白LC3能够发生共定位,说明溶酶体与自噬小体融合的过程并未明显受到AFB1的影响;通过Lysotracker Red和AO染色发现AFB1使溶酶体内部pH升高,溶酶体碱化;Western Blot显示溶酶体腔内组织蛋白酶泄漏,说明溶酶体发生了膜通透化;与溶酶体和自噬小体合成相关的蛋白TFEB发生核异位而被激活,说明溶酶体的生物合成过程未受到影响。以上结果说明AFB1诱导HepG2细胞自噬流后期阻断主要是由溶酶体膜通透化导致的。(3)AFB1暴露对HepG2细胞凋亡的影响。通过MTT实验、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和DAPI染色实验证明不同浓度AFB1处理HepG2细胞48h后能够诱导细胞凋亡的发生,Western Blot检测凋亡相关蛋白:Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达,结果表明AFB1处理后细胞凋亡率增加,细胞内染色质凝集,各凋亡蛋白表达量均升高,从分子和形态学角度证明了AFB1诱导细胞凋亡的发生,并发现在AFB1诱导的自噬和凋亡中,自噬先于凋亡发生。在AFB1诱导细胞凋亡的条件下,再次测定溶酶体内组织蛋白酶D(Cathepin D,CTSD)的表达情况,发现AFB1处理后CTSD由溶酶体腔泄漏进入细胞浆,HepG2细胞内溶酶体组织蛋白泄漏的趋势与细胞凋亡的发生趋势相同,我们推测AFB1诱导的细胞凋亡可能与溶酶体的损伤有很大的关系。