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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是世界范围内对养猪业危害最严重的传染病之一,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。根据基因组与抗原性的差异PRRSV可分为2个基因型,即基因1型和基因2型。近年来,基因1型PRRSV在我国的存在和临床感染受到关注。因此,开展基因1型PRRSV的相关研究十分必要。本研究以基因1型PRRSV毒株GZ11-G1为对象,分析其对仔猪的致病性,构建感染性cDNA克隆,并采用定点突变技术分析与其致病性相关的分子基础,以期为深入开展基因1型PRRSV的致病机制研究奠定必要的技术和前期基础。将基因1型PRRSV毒株GZ11-G1及基因1型疫苗毒株分别接种6周龄SPF猪,观察并记录各实验组感染猪的体温变化、临床症状、病毒血症、体外排毒情况、血清抗体产生动态、组织病变及免疫组化结果。试验结果显示,基因1型PRRSV毒株GZ11-G1能够引起仔猪呼吸道症状并伴随一过性体温升高,体内增殖能力显著高于疫苗毒株,并且能够引起严重的弥漫性间质性肺炎,表明基因1型PRRSV毒株GZ11-G1对仔猪具有致病性。根据基因1型PRRSV毒株GZ11-G1与疫苗毒株的全基因组序列,分段进行RT-PCR扩增,通过同义突变引入酶切位点,连入低拷贝质粒pWSK-29T,获得全长cDNA质粒pWSK-GZ11-G1及pWSK-Amervac。经对全长cDNA质粒线化、体外转录和转染细胞,进行病毒拯救和鉴定。结果表明,构建的基因1型PRRSV毒株GZ11-G1及疫苗毒株的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒,分别命名为Rv-GZ11和Rv-Amervac,拯救病毒具有与亲本病毒相似的体外增殖特性。对GZ11-G1、Amervac PRRS疫苗毒株在内的10株基因1型PRRSV相关区域(5’及3’UTR、ORF1b、ORF2-6)的序列及编码氨基酸序列进行了比对分析。结果表明,GZ11-G1在Nsp9-10区域及GP2分别存在4个和3个氨基酸突变位点,包括Nsp993位甘氨酸(G)、Nsp10281位脯氨酸(P)、304位缬氨酸(V)、401位赖氨酸(K)、GP25位组氨酸(H)、120位甘氨酸(G)和252位丝氨酸(S)。利用感染性克隆技术及定点突变技术拯救出6株突变病毒,分别命名为Rv-A-G-Nsp9-10、 Rv-A-G-GP2+Nsp9-10、Rv-A-G-GP2、Rv-G-A-Nsp9-10、Rv-G-A-GP2和Rv-G-A-GP2+Nsp9-10。体外增殖结果表明,突变GP2的3个氨基酸后,各突变病毒与相应的亲本毒株增殖水平均无显著差异,而突变Nsp9-10的4个氨基酸后,Rv-A-G-Nsp9-10、Rv-A-G-GP2+Nsp9-10早期的病毒滴度均显著提高,而Rv-G-A-Nsp9-10、Rv-G-A-GP2+Nsp9-10病毒滴度达到峰值的时间点分别滞后12h和24h,各时间点的病毒滴度也显著低于亲本拯救毒株(P<0.05)。对突变病毒的致病性分析结果表明,与Rv-Amervac相比,Rv-A-G-Nsp9-10感染猪的临床症状、病毒血症和间质性肺炎更为严重,而Rv-G-A-Nsp9-10较亲本病毒的病毒血症持续时间缩短,感染猪的体温反应和肺脏的病理损伤减轻。结果表明,基因1型PRRSV毒株GZ11-G1的Nsp9的第93位,Nsp10的第261位、304位和401位氨基酸与其增殖能力及致病性增强有关。综上所述,研究结果表明基因1型PRRSV毒株GZ11-G1具有致病性,成功构建了基因1型PRRSV感染性克隆技术,揭示了基因1型PRRSV毒株GZ11-G1 Nsp9和Nsp10中与病毒增殖能力和致病性相关的氨基酸位点,为进一步研究基因1型PRRSV分子致病机制提供了技术平台,并为阐明基因1型PRRSV的致病机制提供了有价值的科学依据。