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目的:ctDNA是一种存在于血浆或血清,脑脊液等体液中的细胞外DNA,主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞,而在早期肿瘤<1cm的病灶,ctDNA技术检测的敏感性和特异性达不到临床应用水平,本实验通过自杀基因作为报告基因,具有高敏感性和假阳性的优点,可以富集ctDNA,从而为早期肿瘤的检测提供了一种新的方法。 方法:选取Pdonr211质粒,在自杀基因ccdb起始密码子后面,通过重叠延伸PCR插入AARI的酶切位点,并加入3n+1和3n的寡核苷酸片段,验证自杀基因的有效性。后续更换AARI的酶切位点为HindIII和KpnI,用来插入包含12位点突变的KRAS的寡核苷酸片段。将51bp包含12位点的KRAS寡核苷酸片段野生和突变片段十百千万比例混合,克隆到自杀基因载体上,验证自杀基因的富集效果。 结果:通过包含KRAS的12热点突变的寡核苷酸片段作为靶点,在起始寡核苷酸片段浓度为20ng的情况下,野生比突变十百千万不同比例混合在自杀基因的选择下可以达到1000甚至更高倍数的ctDNA富集。 结论:用自杀基因作为报告基因具有高敏感性,假阳性的优点,可以达到近10000倍的富集,此方法与DNA测序的结合为早期肿瘤的诊断提供了一种新的方法。