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目的(1)观察栝蒌仁二醇(Karounidiol,Kar)预处理是否对缺氧-复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)损伤心肌细胞具有保护作用。(2)明确Kar预处理是否通过PI3K/Akt/NF-κB通路抑制细胞凋亡,从而对H/R损伤心肌细胞发挥保护作用。(3)明确Kar预处理是否通过PI3K/Akt/mTOR通路调节细胞自噬,进而对H/R损伤心肌细胞发挥保护作用。方法(1)用CCK-8检测Kar对H9c2(2-1)细胞以及AC16细胞的毒性作用以及促增殖作用。(2)建立H9c2(2-1)细胞以及AC16细胞H/R损伤模型,使用不同浓度的Kar预处理,采用CCK-8检测细胞存活,LDH检测细胞死亡,明确Kar对H/R损伤心肌细胞的保护作用及最佳作用剂量。(3)以最佳剂量(10 μmol/L)为Kar作用浓度,在H9c2(2-1)细胞及AC16细胞上同时进行检测,实验分组如下:常氧对照组(Normoxia)、缺氧-复氧组(DMSO+缺氧-复氧,H/R)、栝蒌仁二醇预处理组(Kar+H/R,Kar)、PI3K阻断剂组(LY294002+Kar+H/R,LY294002)、Akt 阻断剂组(Perifosine+Kar+H/R,Perifosine)、NF-κB 阻断剂组(BAY 11-7082+Kar+H/R,BAY 117082)、mTOR 阻断剂组(Rapamycin+Kar+H/R,Rapamycin)。(4)Western blot 检测关键蛋白分子表达:p-PI3K、T-PI3K、p-Akt、T-Akt、p-p65、p65、Cleaved-Caspase-3、T-Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、T-mTOR、P62、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ等蛋白的表达。(5)采用腺病毒介导的自噬双标荧光蛋白探针Ad-mRFP-GFP-LC3分别感染H9c2(2-1)细胞或AC16细胞并分组造模,激光共聚焦显微镜检测自噬流改变。(6)采用TUNEL染色与DAPI复染检测细胞凋亡。结果(1)CCK-8检测结果显示:分别用Kar处理H9c2(2-1)细胞及AC16细胞24 h,与空白对照组及溶剂对照(0.01%DMSO)组相比,不同剂量组Kar(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)均无明显的细胞毒性及促增殖作用(P均>0.05)。(2)与Normoxia组相比,H/R组细胞存活率显著降低,细胞死亡率显著增高(P均<0.01);与H/R组相比,除0.01 μmol/L组外,Kar各剂量组细胞存活率均明显提高(P均<0.05),其中10 μmol/L组作用最强(P<0.01);与H/R组相比,Kar各剂量组的细胞死亡率均显著降低(P均<0.05),且10 μmol/L组效果最为明显(P<0.01)。根据上述实验结果,确定后续实验Kar最佳给药剂量为10 μmol/L。(3)与 Normoxia 组相比,H/R 组 Cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ等蛋白表达均显著升高(P均<0.05),而p-PI3K/T-PI3K、p-Akt/T-Akt、p-p65/p65、p-mTOR/T-mTOR、P62、Bcl-2 等蛋白表达均显著降低(P 均<0.05);与 H/R 组相比,Kar 组 Cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均明显下降(P均<0.05),而 p-PI3K/T-PI3K、p-Akt/T-Akt、p-p65/p65、p-mTOR/T-mTOR、P62、Bcl-2表达均明显上升(P均<0.05);与Kar组相比,LY294002 组、Perifosine 组、BAY 11-7082 组的 Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达均有不同程度上升(P均<0.05),而p-PI3K/T-PI3K、p-Akt/T-Akt、p-p65/p65、Bcl-2蛋白表达均有不同程度下降(P均<0.05);与Kar组相比,LY294002 组、Perifosine 组、Rapamycin 组的 Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均有不同程度升高(P均<0.05),p-PI3K/T-PI3K、p-Akt/T-Akt、p-mTOR/T-mTOR、P62表达均有不同程度降低(P均<0.05)。(4)Ad-mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒荧光蛋白探针的激光共聚检测结果显示:与Normoxia组相比,H/R组黄色和红色荧光斑点明显增多;与H/R组相比,Kar组黄色和红色荧光斑点均明显减少;与Kar组相比,LY294002组、Perifosine组、Rapamycin组的黄色和红色荧光斑点均有不同程度增加。(5)TUNEL染色与DAPI复染凋亡检测的结果显示:与Normoxia组相比,H/R组绿色荧光明显增多;与H/R组相比,Kar组绿色荧光明显降低;与Kar组相比,LY294002组、Perifosine组、BAY 11-7082组的绿色荧光均有不同程度增加。结论(1)栝蒌仁二醇预处理对缺氧-复氧损伤的心肌细胞具有保护作用。(2)栝蒌仁二醇预处理可通过激活PI3K/Akt/NF-κ(B通路抑制细胞凋亡,从而发挥对缺氧-复氧损伤心肌保细胞的保护作用。(3)栝蒌仁二醇预处理可通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制细胞自噬,从而发挥对缺氧-复氧损伤心肌细胞的保护作用。