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目的为了增强种植体穿龈部分的软组织愈合,阻止细菌入侵,保证种植体长期稳定性,制作合适的微沟槽尺寸和抗菌涂层,确定“接触诱导”信号传导机制。进一步寻找细胞生物相容性好,“接触诱导”性能优越,同时具有抗菌性能的种植体穿龈部分材料表面。方法第一部分:原代培养人牙龈成纤维细胞(HGF),针对细胞大小设计不同沟槽尺寸,利用光刻技术制作微沟槽形貌,沟槽宽度等于间隔分别为15μm,30μm,60μm,沟槽的深度为5μm和10μm,分组为T15/5,T15/10,T30/5,T30/10,T60/5,T60/10,光滑钛(T0)表面为对照组,测量各组材料表面形貌,粗糙度,亲水性等理化性能,通过通过免疫荧光和扫描电镜观察细胞“接触诱导”的形态,利用CCK-8,流式细胞检测细胞增殖和细胞周期推进的差异,通过Realtime-PCR和Western blotting比较粘着斑附着(FAs)相关蛋白(Intergrina5,Intergrinβ1,vinculin)的基因和蛋白水平的表达,进一步比较对血浆和细胞来源FN吸附和分泌的差异,对比不同沟槽上方“接触诱导”相关信号蛋白活化(p-FAK及GTP-RhoA/ROCK)的差异,综合研究结果选择最优的沟槽尺寸通过相应的信号蛋白活化抑制剂,最终明确“接触诱导”的机制及信号通路之间的串话。第二部分:通过第一部分选择的沟槽尺寸利用磁控溅射制备纳米氮化钛(TiN)和银涂层(Ag),与钛光滑表面(Ti-S)相比,实验组为光滑表面制备抗菌涂层:Ag-S,TiN-S,沟槽表面制备抗菌涂层:Ti-MG,Ag-MG,TiN-MG。通过检测材料表面微沟槽形貌(SEM),纳米涂层形貌和粗糙度(AFM),亲水性测量,元素分析以及Ag+释放进一步明确材料表面理化性能,进一步研究抗菌纳米涂层与微沟槽形貌结合后对HGF的细胞生物相容性,“接触诱导”效应的影响以及对牙龈卟啉单胞菌(Pg)的抗菌作用差异。结果1.光刻技术成功制备具有沟槽形貌的钛表面,各组宽度和深度呈典型的各向异性平行排列,微米级粗糙度均高于T0,其中T60/10最高,T15/5最低;T60/5表面亲水性最好,T15/10疏水性最大甚至大于光滑组T0;2.不同尺寸沟槽表面对HGF的增殖和细胞周期推进不同,T60/10具有促进早期粘附作用,细胞增殖的幅度最大,增殖的时间最长,细胞周期S期占有的细胞比例最大;3.不同尺寸沟槽对HGF均成功的起到了“接触诱导”的作用,但诱导程度不同,细胞排列一致性T60最高,T15最低,细胞骨架形变率T60/10最高;4.与FAs相关的重要蛋白(Intergrina5,Intergrinβ1,vinculin)于T60/10沟槽上方表达最高。5.T60对血浆FN的吸附最差,对细胞FN分泌刺激作用最好;6.与“接触诱导”相关的信号蛋白的活化:p-FAK,GTP-RhoA/ROCK于T60/10组表达最高,p-FAK于T30与T15没有差异,GTP-RhoA在T15表达高于T30,ROCK在T30组表达高于T15组;7.选择T60/10为最优的沟槽尺寸,此时抑制p-FAK对细胞排列一致性没有太大的影响,对RhoA-GTP的活化影响无统计学意义,分别对RhoA-GTP/ROCK信号蛋白进行抑制均不同程度影响了“接触诱导”效应,以ROCK抑制更为明显,对RhoA-GTP抑制的同时也减少了FAK蛋白的磷酸化。8.通过磁控溅射技术成功实现在光滑和选定沟槽上方制作抗菌TiN,Ag涂层,能够保持材料原有形貌且赋予材料新的理化表面,其中纳米粗糙度TiN最小,Ag涂层表面最大,亲水性TiN-MG最好,Ag-S最差,XPS可见TiN涂层上方含间隙氮和氧,Ag涂层上方含氧量最少是导致亲水性下降的原因,沟槽表面的Ag+释放高于光滑表面,且释放量持续7d均高于0.1ppb(最低抗菌浓度);9.不同涂层表面影响细胞增殖和细胞周期的推进,Ag涂层表面细胞增殖和细胞周期S期占有的比例低于其他涂层表面,TiN-MG表面细胞增殖和细胞周期S期占有的比例最高,不同涂层上方细胞FAs相关蛋白的表达存在差异,Ag涂层上方Intergrina5,Intergrinβ1,FN,Vinculin的表达均比其他涂层表面少,而TiN-MG表达最高。Ag-MG,TiN-MG都能成功诱导细胞顺着沟槽排列,细胞排列一致性比例无差异,不同涂层沟槽表面“接触诱导”相关的信号蛋白p-FAK以及ROCK表达均高于光滑表面,ROCK活化与表面化学成分无关,而Ag涂层的沟槽表面p-FAK相对较低于Ti-MG和TiN-MG。10.Ag涂层的抗菌作用最强,TiN涂层的抗菌能力居中,相同涂层下沟槽形貌并没有增加细菌的粘附量。结论1.T60/10作为各向异性微沟槽的表面亲水性好,最有利于HGF粘附增殖和细胞周期推进,对HGF的“接触诱导”效应最好:细胞排列一致性和细胞骨架形变率最高,此外FAs相关的蛋白和“接触诱导”相关的信号蛋白在基因和蛋白水平上表达和活化度均最高,虽然对血浆FN的吸附弱于其他沟槽表面,但对细胞FN的分泌刺激作用最好,由于细胞来源的FN能弥补血浆来源FN的功能,最终T60/10建议为种植体穿龈部分最合适的沟槽尺寸。2.利用磁控溅射技术成功的实现了同时具有微沟槽形貌(T60/10)又具有抗菌功能的纳米涂层,其中微沟槽上方制作Ag涂层细胞相容性较差,而抗菌性最高,而微沟槽上方制作纳米TiN涂层具有一定的抗菌性能及最优的细胞生物相容性亦保持了“接触诱导”效应,因此纳米TiN涂层推荐与T60/10的微沟槽结合作为具有抗菌性能的种植体穿龈部分的材料表面。