研究背景及目的免疫治疗成为继手术、放疗、化疗后第四种治疗肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗方法,免疫治疗按照机制的不同可以分为主动性与被动性(或称为过继性)免疫治疗两大类,主动免疫治疗如治疗前列腺癌的DC疫苗等;过继性免疫治疗,即将各种免疫效应细胞、细胞因子或单克隆抗体输入机体,直接介导抗肿瘤免疫反应。过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是免疫治疗发展历程中的重要里程碑,迄今为止主要应用的细胞类型有肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,TIL),树突状细胞-杀伤性T淋巴细胞(Dendritic cell,Cytotoxic T lymphocyte,DC-CTL)以及近年新出现的嵌合抗原受体的T淋巴细胞(Chimeric antigen receptors of T cells,CAR-T)等,尤其是 CAR-T 目前在白血病治疗中疗效肯定,对部分实体瘤患者的临床试验也取得令人鼓舞的效果。原发性肝癌是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,其中发生于肝细胞的恶性肿瘤就是原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)约占原发性肝癌的90%。确诊时,大多数HCC患者已达BCLC中晚期(80%),只有15.3%的是BCLC早期。根据目前的HCC治疗指南,早期的患者可以选择手术、肝移植、射频消融等根治性方法,而对于那么多的中晚期HCC患者来说,仅有化疗和索拉菲尼这两种姑息性治疗方法可选择,因此需要探索新的治疗方法造福于中晚期肝癌患者。近年来对原发性肝细胞癌患者也进行了一系列免疫治疗的试验,目的是评估免疫治疗技术治疗HCC的效果。本研究采用14种肿瘤抗原多肽负载DC(muture dendritic cells,mDCs)的技术,给HCC患者皮下注射DC,并培养诱导CTL(cytotoxic T lymphocytes)静脉回输HCC患者体内,旨在探索联合了主动免疫与被动免疫的多靶点抗原肽自体免疫细胞技术(Multiple Antigen Stimulating Cellular Therapy,MASCTTM)治疗HCC的安全性及诱发患者体内免疫应答的机理研究,为其临床推广应用提供依据。并初步探讨MASCTTM是否能给HCC患者带来临床获益。研究方法1、MASCTTM治疗原发性肝细胞癌患者的临床安全性研究回顾性分析2012年1月至2014年12月期间南方医院肝病中心收治的接受MASCTTM且治疗前的末次治疗(手术、化疗、放疗)结束至少一个月或以上,并且未接受其他免疫治疗的45例原发性肝细胞癌患者的临床资料。第0天分离患者外周血单个核细胞,其中贴壁细胞诱导培养为成熟DC,负载14种抗原肽,小部分mDCs第8天经患者腹股沟淋巴结周围区皮下注射;未贴壁细胞第7天与大部分mDCs共培养诱导为CTL,第26天经静脉回输患者体内,对回输的DC及CTL进行细胞表型及细胞因子分泌检测。分析输注细胞后的不良反应的临床表现、血常规、肝肾功能变化。2、MASCTTM诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究分为回顾性和前瞻性免疫应答机理研究,回顾性机理研究对象为未曾接受MASCTTM治疗与接受多次MASCTTM治疗的原发性肝细胞癌患者,采集原发性肝细胞癌患者外周血分离并获取单个核细胞,对比分析治疗前后T细胞亚群(流式细胞术)、特异性T细胞增殖(EdU检测)以及多靶点肿瘤抗原特异性免疫应答(ELISPOT检测)变化情况;前瞻性机理研究对象是随机纳入临床试验的不接受MASCTTM治疗的对照组和接受MASCTTM治疗的试验组的根治术后的HCC患者,同样对比两组之间T细胞亚群(流式细胞术)、特异性T细胞增殖(EdU检测)以及肿瘤抗原特异性免疫应答变化。分析体内免疫应答的情况,分别进行以下检测:1)T细胞亚群检测(流式细胞术):将分离得到的PBMC预处理后收集细胞悬液并离心,按照流式细胞染色实验步骤进行染色,染色方案为NKT(CD3+CD56+);CD8+NKG2D+Granzyme B+CD107a+;Treg(CD4+CD25+FoxP3+);CD45RO-FITC CD27-Percp-Cy5.5 CD57-APC CCR7-PE CD3-APC-Cy7,最后用FACS CantoⅡ流式细胞仪上机检测。2)抗原特异性T细胞增殖(EdU染色方法)及IFN-y水平测定(流式细胞术):将分离得到的PBMC给予无关肽、肝癌多靶点抗原肽库及细胞因子预刺激处理3天后收集细胞悬液并离心,按照流式细胞染色实验步骤进行染色,增殖实验染色方案为CD3-PE EdU-FITC;IFN-γ分泌检测染色方案为:CD8-APC-Cy7 CD4-PE CD27-PerCP-Cy5.5 CD28-FITC IFN-y-APC。最后用 FACS CantoⅡ流式细胞仪上机检测各类细胞比例。计算肽库组检测值/无关肽检测值的倍数。3)各肿瘤抗原肽特异性免疫应答检测(ELISPOT方法):将分离得到的PBMC分别给予无关肽、肝癌多靶点抗原肽库、各类抗原单条肽预刺激处理3天后,按照酶联免疫斑点检测方法(ELISPOT方法)进行检测,晾干板,用 ELISpotreader(AID EliSpot Reader classic)检测并统计斑点数。计算目标肽斑点数/无关肽斑点数的倍数。3、MASCTTM治疗原发性肝细胞癌临床效应的初步探究选取2012年1月之后确诊为原发性肝细胞癌BCLC分期B期并在南方医院肝病中心规律接受治疗(包括传统治疗和/或MASCTTM治疗),且定期返回南方医院进行复查随访的患者为研究对象,根据RECIST评估标准,回顾性比较接受传统治疗联合多次MASCTTM治疗(≥3次)和只接受传统治疗的BCLC分期B期的原发性肝细胞癌患者1年内疾病进展情况(disease control rate,DCR),初步探索MASCTTM免疫治疗能否控制HCC疾病发展。4、统计学分析应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多次重复测量均数比较采用单因素重复测量资料方差分析。计数资料组间两两比较用卡方检验或Fisher’s精确检验。作图用GraphPad Prism软件。P<0.05有显著统计学差异。研究结果1、MASCTTM成功诱导培养mDC和CTL,MASCTTM治疗后患者不良反应少纳入的45例原发性肝细胞癌患者中男性43例,女性2例,年龄30-65岁,平均年龄53.78岁。大约91.1%患者合并慢性乙型肝炎病毒(88.9%)或慢性丙型肝炎病毒(2.2%)感染。按照Child-Pugh评分标准,45例原发性肝细胞癌患者肝功能均为A级(57.8%)或B级(42.2%),按照巴塞罗那临床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC)分期标准,其中A期7例,B期13例,C期19例,D期6例。45例患者中,14例接受过手术切除治疗(31.1%),33例曾行肝动脉栓塞术(73.2%),10例进行过射频消融术(22.2%),45例患者接受MASCTTM治疗次数为1至10次不等(平均治疗3.78次/人)。MASCTTM培养的mDCs中CD80+细胞比例为(98.5±5)%、CD83+细胞为(88±10)%、CD86+细胞为(98.4±3)%,HLA-DR+细胞为(98.8±2)%,mDCs 分泌高水平 IL-12(985±312 pg/ml),低水平IL-10(53±10 pg/ml)。CTL 中 CD3+CD8+细胞为(83±10)%,CD3+CD56+细胞为(24±5)%。CTL 分泌高水平 IFN-y(1222±650 pg/ml),低水平IL-10(6.8±5.0 pg/ml)。MASCTTM治疗后,绝大多数患者的精神、食欲、睡眠、体力较前好转,有2名(4.44%)患者在输注CTL细胞1h后出现轻中度发热,未观察到其他严重明显不良反应。患者的血常规、肾功能均无明显异常变化,肝功能有轻度升高趋势。未发现与MASCTTM相关的死亡事件。2、多次MASCTTM治疗后改善原发性肝细胞癌患者体内免疫抑制状况,诱导特异性免疫应答多次MASCTTM治疗组的患者外周血NKT(CD3+CD56+)比例上调、Treg(CD4+CD25+FoxP3+)下调、共表达杀伤相关分子(NKG2D,Granzyme B,CD 107a)的CD8+T细胞比例上调,效应T细胞(effect T cell,Te)、中央记忆性T细胞(center memory T cell,Tcm)比例也明显上调。在体外将PBMC分别用HCC抗原肽库和无关肽刺激培养后检测T细胞的增殖能力(EdU检测方法)和分泌IFN-r的能力(流式细胞术)以及对各个肿瘤抗原的特异性应答(ELISPOT检测方法),多次MASCTTM治疗的HCC患者外周血中T细胞增殖能力、分泌IFN-γ的能力均显著提高且T细胞对HCC抗原肽库产生了应答,不同患者对肝癌多靶点抗原肽库中不同单肽产生不同程度应答。3、MASCTTM治疗+传统治疗的BCLC B期原发性肝细胞癌患者1年内疾病控制率为80%纳入研究的32名BCLC分期B期HCC患者,其中有15名接受多次MASCTTM治疗(≥3次),有17名接受了传统治疗,观察分析并比较接受传统治疗联合多次MASCTTM治疗组患者1年内疾病进展情况(disease control rate,DCR)与只接受传统治疗的原发性肝细胞癌患者,接受了多次MASCTTM治疗的HCC患者1年内的疾病控制率为80%,传统标准治疗组为17.65%。研究结论1、本研究表明MASCTTM治疗原发性肝细胞癌患者不良反应较少,临床应用安全性良好,可为其临床推广应用提供依据。2、MASCTTM治疗技术可改善HCC患者体内免疫抑制状态,诱导针对肿瘤抗原肽的特异性免疫应答,可对肽库中不同的抗原肽产生特异性免疫应答,且会随着治疗次数的增加而增强应答。3、MASCTTM治疗HCC的临床疗效还有待临床试验的研究结果。