抑郁症是全球性严重危害人类健康的主要疾病之一。抑郁症的发病率逐年递增,已上升到全球普通疾病前10位。而其10%～15%的高自杀率已引起人们的高度重视。1994年美国国家疾病谱调查(NCS)结果表明,抑郁症终身患病率为17.1%,男性为12.7%,女性为21.3%。美国于2003年进行的再次疾病谱调查结果显示：抑郁症的终身患病率为16%。而在中国,尚无关于抑郁症人群的最新统计数字,目前的统计数字来自1982年。据最保守的估计,目前中国内地抑郁症发病率约为2.4%,即抑郁症患者已超过2600万人。抑郁症现状的严峻,表明我们所生存的时代的心理健康状况不容乐观,同时也给世界各国的医学专家、科研人员和政府机构提出了迫切的要求：加强抑郁症及抗抑郁治疗的机制研究,提高防治和康复的水平。在机制研究方面：最经典的是单胺类递质假说,即5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)功能低下,这一论点成为抑郁症机制研究的奠基石已逾50年。由此而发展起来的抗抑郁药物：三环类抗抑郁药(TCAs)、5-HT重摄取抑制剂(SSRIs)和单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)等,至今为止仍为临床一线抗抑郁药。这些药物在数十分钟或者数小时内即可显著增加突触间隙内单胺类递质浓度,但是其发挥临床疗效,改善症状往往需要4-6周的时间。对于这一临床药理学现象,到目前为止,许多针对单胺类递质转运体、受体的研究都未能满意地予以解释。近年来提出的神经发生(neurogenesis)假说使神经科学研究者有希望更深入地阐明抗抑郁药起效迟缓的临床药理现象。抗抑郁药诱导神经干／祖细胞增殖、分化,进而使新生神经元整合进入神经网络所需的时间(2-4周)与临床抗抑郁药的起效延迟十分吻合[8]。科学家们推测抗抑郁药治疗可能通过诱导海马新生神经元的产生,促进成年大脑边缘皮层正常功能的恢复而发挥临床疗效。很多研究,包括本实验室的研究结果表明——大多数抗抑郁药物(TCAs, SSRIs等)呈现抗抑郁效果的同时可以显著促进神经发生的恢复,局部放射性照射阻断海马颗粒细胞下区(SGZ)神经发生的同时也拮抗抗抑郁药的抗抑郁效果。而且,只有在慢性持续给药而非急性大剂量给药情况下,抗抑郁药物才能诱导神经发生,这与抗抑郁药发挥临床疗效具有相同的时程性。此外,神经营养因子(促进神经发生)具有抗抑郁效果。相关实验结果说明神经网络和海马等边缘皮层的信息联系的受损和退变可能是抑郁症发病的关键因素,而抗抑郁药则很有可能通过促进神经发生,诱导新生神经元的产生,并促进其迁移、分化、成熟,并与现有神经网络进行整合,从而使受损的边缘脑区的功能恢复,达到治疗效果。那么,抗抑郁药究竟如何调控成年海马的神经发生呢?近年来,有科学家推测,抗抑郁药调控成年海马神经发生可能是通过上调海马SGZ区内的5-HT浓度,,继而通过5-HT的受体,发挥神经递质/营养作用,从而促进海马内神经发生的恢复。但是一直未能在在体的神经干/祖细胞上发现5-HT受体表达,同时,5-HT递质系统的纤维投射也仅到达了海马齿状回(DG)的海马门的部位。并且到目前为止,无实验证据表明5-HT能神经纤维与海马SGZ区的神经干/祖细胞有直接的突触联系,这些都使抗抑郁药通过上调5-HT而间接调控神经干/祖细胞这一假说受到质疑。此外,上述各种抗抑郁药作为一种小分子物质,可以穿过血脑屏障,进入任何一个脑区,包括扩散入海马内的SGZ区,SGZ区又被认为是海马神经发生微环境(the Neurogenic Niche)。那么,这类小分子药物是否可以发挥直接作用,直接调控神经干/祖细胞的增殖、迁移、分化、成熟等步骤?已有一些离体实验表明SSRIs及三环类抗抑郁药对神经干/祖细胞具有直接促增殖、促分化作用。但是,真正要确认抗抑郁药对神经干/祖细胞的直接调控作用,还需进一步的深入研究。而抗抑郁药对神经干/祖细胞直接调控作用能得到确认之后,这一调控作用的胞内分子机制的特点则将成为下一步研究的重点。根据我们前期在动物实验中得出的结果：三环类抗抑郁药在多种抑郁症动物模型中都具有良好的抗抑郁作用,而且,在慢性不可预知的复合刺激诱导的抑郁症大鼠模型中,氯丙咪嗪不但具有良好的抗抑郁作用同时显著恢复由于应激刺激而抑制的海马的神经发生,促进新生神经元、胶质细胞的产生。因此,本篇论文选用氯丙咪嗪进行离体细胞实验,是为了进一步阐明抗抑郁药调控神经发生的相关胞内分子机制。同时阐明氯丙咪嗪调控神经干/祖细胞增殖或分化的胞内信号分子也将为进一步寻找新的治疗靶点提供依据。越来越多的研究关注调控神经发生的细胞内信号通路。例如cAMP-CREB信号通路可能参与调控新生神经元的存活。因为激活cAMP-CREB信号通路可以增加海马内BDNF的表达,继而增加成年脑内的神经发生。这有可能是抑郁症或抗抑郁治疗影响海马神经发生的途径之一。现有结果暗示CREB可能是多种抗抑郁药物的作用汇聚点。但是到目前为止这一假说仍然只有极少量的研究支持。我们的研究可能为这方面的研究增加新的证据。此外,这一信号通路的激活引起的下游靶基因的变化也是本研究的另一靶点。总之,揭示抗抑郁药调控海马神经发生的分子机制,将为深入阐明其治病机理及抑郁症发病机制提供新的突破点；也为寻求新治疗靶点,探索新治疗方法开拓新思路,为提高临床疗效提供理论依据和实验基础。本论文从两个方面阐明抗抑郁药调控海马神经干/祖细胞增殖、分化的分子机制。首先,在体外培养的神经干/祖细胞系统中,观察三环类抗抑郁药氯丙咪嗪是否可以直接调控海马神经干/祖细胞：a)建立体外海马神经干/祖细胞培养体系；b)明确氯丙咪嗪对海马神经干/祖细胞的增殖、分化的作用；c)同时明确具有直接调控作用的氯丙咪嗪的最佳剂量；其次,进一步通过分子生物学方法,探寻三环类抗抑郁药氯丙咪嗪直接调控成年海马神经干/祖细胞的胞内分子机制：a)观察胞内信号分子在氯丙咪嗪调控神经干/祖细胞增殖时的表达差异；b)利用工具药调控胞内信号分子磷酸化,继而观察对氯丙咪嗪调控神经干/祖细胞分化、增殖作用的影响；c)利用基因表达芯片寻找相关信号分子下游的靶基因。主要实验结果如下：1)三环类抗抑郁药氯丙咪嗪可以直接调控海马神经干/祖细胞a)建立稳定的体外海马神经干/祖细胞培养体系体外培养的海马神经干/祖细胞可以在体外培养环境中稳定增殖,并且在撤除促有丝分裂因子后,贴壁分化,可以分化出神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。b)明确氯丙咪嗪对海马神经干/祖细胞的增殖、分化的作用在bFGF/EGF存在情况下,氯丙咪嗪可以协同bFGF/EGF进一步促进海马神经干/祖细胞的增殖,而在分化培养基中,氯丙咪嗪具有促进神经干/祖细胞分化的作用,其中神经胶质细胞分化明显增多。c)明确具有直接调控作用的氯丙咪嗪的最佳剂量在观察氯丙咪嗪的促分化和增殖作用时显示,2μM和5μM的氯丙咪嗪具有明显的促增殖和分化的作用,而20μM的氯丙咪嗪已经明显的抑制增殖和分化的作用2)明确三环类抗抑郁药氯丙咪嗪直接调控成年海马神经干/祖细胞的胞内分子机制a)胞内信号分子在氯丙咪嗪调控干/祖细胞分化、增殖时的表达差异胞内多条信号分子参与干/祖细胞增殖与分化过程,其中c-Srk, Rsk, ERK等信号分子可能参与了氯丙咪嗪调控神经干／祖细胞的胞内信息传递。b)利用工具药调控胞内信号分子对氯丙咪嗪调控神经干／祖细胞增殖作用的影响根据胞内信号分子的时程变化,在18h和42h分别给予p-ERK的抑制剂PD98059和U0126,发现可以部分拮抗氯丙咪嗪的促增殖作用。c)利用基因表达芯片寻找相关信号分子下游的靶基因通过神经干细胞芯片检测,在加有2μM的氯丙咪嗪的增殖培养基中培养的神经干/祖细胞与对照的神经干/祖细胞相比,GDNF的mRNA表达显著上调。此外,氯丙咪嗪促分化的作用可能与靶基因Bone morphogenetic protein 15, Bone morphogenetic protein 8a, GDNF, Pleiotrophin表达上调及Neuropilin 1表达下调相关。综上所述,本研究可获得以下结论：1.氯丙咪嗪具有促进海马神经干/祖细胞的增殖与分化的作用2.氯丙咪嗪可能通过调控胞内信号分子ERK信号通路继而促进靶基因CDNF表达而起到促增殖的作用3.氯丙咪嗪发挥促分化的作用可能与上调靶基因Bone morphogenetic protein 15,Bone morphogenetic protein 8a, GDNF, Pleiotrophin,下调Neuropilin 1相关,但是这些靶蛋白在氯丙咪嗪调控神经干/祖细胞分化中的确切作用尚需进一步研究。