姜花萜类合成酶基因的克隆及表达分析

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姜花(Hedychium coronarium Koenig)为姜科姜花属多年生草本植物,单子叶,因其花似蝴蝶,故又名蝴蝶花、蝴蝶姜。香气作为花卉不可缺少的一个重要品质,是构成和影响花卉观赏价值的主要因素之一。不同的姜花其香气不同,其中,白色姜花由于具有浓郁的香气而倍受人们的青睐,植物的香味是由其含有的不同挥发性物质所决定的,这些物质可分为三大类:萜类、苯基/苯丙烷类、脂肪酸衍生物,其中白姜花的香味主要组分是萜类化合物。本研究以单子叶植物白姜花为材料,采用RT-PCR及RACE技术,在白姜花中克隆到萜类合成酶基因,并对克隆到的基因进行了表达分析的初步探索。结果如下:   1.利用RT-PCR与RACE相结合的方法,在白姜花的花中克隆得到一个萜类合成酶基因的cDNA全长序列,并命名为Hc-tps6;Hc-tps6基因全长为1971 bp,ORF全长1668 bp,编码566个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列含有单萜合成酶的保守序列:DDXXD和RRX8W。基因的系统进化分析表明Hc-tps6基因属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-b亚族的单萜合成酶,因此我们推测这个基因是单萜合成酶基因。   2.采用普通PCR技术,成功地从白姜花中克隆得到了萜类合成酶基因Hc-tps6的DNA全长。全长核苷酸序列长度为2154 bp,包含6个内含子和7个外显子,且剪切位置均符合“GT-AG”法则。其中,6个内含子分别位于第112-183位、第458-543位、第929-1006位、第1226-1298位、第1438-1520位和第1767-1857位,大小分别为72bp、86bp、78 bp、73 bp、83 bp和91 bp:7个外显子分别位于第1-111位、第184-457位、第544-928位、第1007-1225位、第1299-1437位、第1521-1766位和第1858-2154位,大小分别为lll bp、274 bp、385 bp、219 bp、139bp、246 bp和297 bp。   3.半定量结果显示Hc-tps6在白姜花的花萼和花瓣中表达较强,苞片、茎和叶上也有轻微表达。就相同器官或组织而言,随着发育时期的递进,表达量基本都是呈增高趋势。青蕾期几乎没有表达,在所选取的四个品种中,Hc-tps6在香气最重的白姜花中表达量最大,表明此基因与香气的形成释放存在一定相关性,该基因很可能参与了香气的形成。   4.提取白姜花的基因组DNA,酶切后进行Southen杂交,结果显示,Hc-tps6基因是一个多拷贝基因。   5.在成功克隆Hc-tps6的基础上,将Hc-tps6构建到原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中成功表达,表达产物经SDS-PAGE检测,所表达的重组蛋白主要以可溶性蛋白存在。经镍离子亲和层析柱一步法得到高回收率的Hc-tps6纯化蛋白。
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