论文部分内容阅读
目的:卵巢癌（Ovarian Cancer,OC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,卵巢癌最大特点是发病隐匿,卵巢癌细胞腹膜传播快、范围广,药物治疗容易产生耐药性,虽然目前对于卵巢癌的检测方法和治疗手段都有了很大发展,但是卵巢癌患者的五年相对生存率一直维持在30%～40%的低水平发展。目前临床上通常采用手术治疗和化疗为主的综合性治疗手段,但随着治疗过程的延长,化疗药物的毒副作用和机体产生耐药性问题日趋严重,而在中药治疗卵巢癌,特别是晚期卵巢癌手术后或非手术患者时显示了明显的优势。中医药治疗卵巢癌不仅可以提高患者的免疫力、减轻放化疗后的副作用,还能延长患者的寿命,改善患者的生存质量。草果（Amomum tsaoko）为姜科（Zingiberaceaae）豆蔻属（Amomum Roxb）草果的成熟干燥果实,性辛温,归脾胃经,具有燥湿温中、截疟除痰的功效,用于治疗寒湿内盛、脘腹胀痛、脾满呕吐、疟疾寒热、瘟疫发热等证。草果在中国是作为一种传统的药食同源植物,广泛应用于国内食品香料行业中。现有研究主要集中于挥发性成分的分析、提取以及种植方面,药理实验研究表明草果的生物活性表现也具有多样性:抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、降血糖等多种活性都有涉及。抗肿瘤的研究发现了草果挥发油能诱导鼻咽癌6-10B细胞调亡,能明显抑制肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长。古代医药记载草果组方可用于妇科诸疾,现代临床上发现用草果水煎液可以治疗妇科腹部手术的脘腹胀痛。在对姜科类药材抗卵巢癌的活性筛选的预实验中,草果乙醇提取物（At-EE）抗卵巢癌的活性最好,故本论文以At-EE作为抗卵巢癌的研究对象。血管生成是肿瘤生长的关键因素之一,靶向血管生成已经是癌症临床治疗的方法之一。本论文发现At-EE抑制卵巢癌活性与其抑制血管生成之间存在联系,并且找出了At-EE抑制肿瘤血管生成的相关细胞因子和潜在通路,这为从草果中分离、筛选抗卵巢癌的药物研究提供了有利证据。方法:1.采取乙醇回流提取制备草果乙醇提取物（At-EE）,分别以芦丁和没食子酸作为标准检测At-EE中的黄酮类和酚类化合物的含量。制备质量稳定、可靠的草果提取物。2.a)建立荧光素酶标记的SKOV3原位移植瘤小鼠模型,考察At-EE给药后对于小鼠体内卵巢瘤的分布扩散情况;b)通过在小鼠后背皮下移植SKOV3肿瘤细胞,建立卵巢瘤的荷瘤小鼠模型,考察At-EE对卵巢瘤的抑制作用;c)将剥离的肿瘤组织切片染色进行免疫组化分析检测了CD31的表达,计数肿瘤细胞中微血管平均值MVD。3.a)采用MTT法考察At-EE对卵巢癌SKOV3细胞、人脐静脉内皮细胞HUVEC、人永生化表皮细胞Ha Ca T增殖的体外抑制作用;b)采用Annexin V-FITC双染法考察At-EE对SKOV3细胞、HUVEC细胞、Ha Ca T细胞凋亡的影响;c)利用Transwell小室建立SKOV3细胞和HUVEC细胞共培养模型,通过At-EE对正常培养的HUVEC细胞、与SKOV3细胞共培的HUVEC细胞的划痕实验、侵袭实验、体外血管生成实验,来研究At-EE对HUVEC细胞、与SKOV3细胞共培的HUVEC细胞的迁移、侵袭、体外血管生成能力的影响。4.a)利用RT-PCR技术检测SKOV3细胞分泌相关细胞因子的m RNA水平,确定At-EE影响共培细胞迁移、侵袭、血管生成能力的关键细胞因子是IL-6和VEGF;b)利用ELISA实验验证At-EE能抑制卵巢癌SKOV3细胞因子VEGF、IL-6的表达水平;c)利用划痕实验验证VEGF、IL-6参与At-EE抑制内皮细胞HUVEC迁移,利用体外血管生成实验验证VEGF、IL-6参与At-EE抑制内皮细胞HUVEC的成管能力。5.利用Western Blot法分析At-EE处理的SKOV3细胞中p-STAT3和NF-κB的表达,以及NF-κB/p-STAT3和IL-6/VEGF相互作用关系。6.利用WB法检测At-EE处理的SKOV3细胞中GRP78和CHOP表达;通过沉默SKOV3细胞CHOP基因后WB法检测NF-κB/p-STAT3的表达;通过沉默SKOV3细胞CHOP基因后ELISA实验检测SKOV3细胞中IL-6/VEGF的表达;免疫组织化学染色检测NF-κB、p-STAT3、CHOP、VEGF、IL-6的表达。结果:1.对1 kg的草果药材乙醇回流提取干燥后得到198.6 g草果乙醇提取干粉。紫外-可见分光光度法以芦丁为对照品测定的总黄酮的含量,计算其平均含量为32.14 mg/g,RSD为1.134%;以没食子酸为对照品测定的总酚含量,计算其平均含量为112.23 mg/g,RSD为0.532%。2.a)空白对照组小鼠下腹部的荧光点面积和亮度高于At-EE给药组小鼠,据荧光斑点强度面积计算4周后的每只荷瘤小鼠体内的SKOV3细胞的个数,At-EE给药组SKOV3细胞数目3.5×10~6显著低于空白组细胞数目6×10~6（P＜0.01）;b)空白对照组小鼠中剥离的肿瘤重量（1.18±0.31 g）明显比给药组小鼠的肿瘤（0.78±0.12 g）重,肿瘤体积也能看出空白对照组的小鼠肿瘤体积随着时间的增长速度快,说明At-EE对SKOV3实体肿瘤生长有良好的抑制作用;c)空白对照组细胞浆内可见大量成片状的深棕色颗粒,表达呈强阳性,At-EE给药组细胞浆内有散在的少量的棕色颗粒,表达呈弱阳性。空白对照组肿瘤组织中MVD-CD31值全部高于At-EE给药组,两组的MVD-CD31的平均值之间存在着显著差异（P＜0.05）。3.a)分别用0、20、40、60、80、100μg/m L的At-EE分别处理SKOV3、HUVEC、Ha Ca T细胞,MTT法测定计算细胞相对活力（%）,结果可知随着At-EE的浓度的增加,SKOV3细胞活力逐渐降低,内皮细胞HUVEC、表皮细胞Ha Ca T的细胞活力不受影响;b)用0、10、20、40、60、80、100μg/m L At-EE分别作用于SKOV3细胞,根据Annexin V-FITC/PI法检测凋亡率,随着At-EE的浓度的增加,人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡率显著增加。采用同样的方法检测不同浓度At-EE处理的HUVEC、Ha Ca T细胞的凋亡率,HUVEC、Ha Ca T细胞凋亡率在At-EE浓度范围0～100μg/m L内无显著性差异;c)对于HUVEC细胞、共培HUVEC细胞、5μg/m L At-EE处理共培HUVEC细胞、10μg/m L At-EE处理共培HUVEC细胞的划痕实验、侵袭实验、体外血管形成实验说明At-EE不会直接影响HUVEC细胞,但At-EE可以显著抑制共培养后内皮细胞HUVEC迁移、侵袭和体外血管生成能力的提升,并且该能力随着At-EE药物浓度的增加而增强,呈现浓度依赖性。4.a)通过RT-PCR实验技术检测卵巢癌细胞SKOV3和10μg/m L At-EE处理的SKOV3细胞的VEGF、IL-6、IL-8、FGF、MCP-1和OPN六种细胞因子的m RNA表达。结果显示At-EE处理组的VEGF（P＜0.05）、IL-6（P＜0.01）的m RNA表达水平对比对照组下降显著;b)ELISA检测的IL-6的蛋白浓度:空白对照组IL-6浓度为14.87±1.31 pg/m L,而5μg/m L、10μg/m L At-EE处理的SKOV3细胞培养液中IL-6浓度依次为8.75±0.73 pg/m L、6.97±0.87 pg/m L,这两组均与对照组有显著性差异;ELISA检测的VEGF的蛋白浓度:空白对照组中VEGF浓度为21.14±1.56 pg/m L,而5μg/m L、10μg/m L At-EE处理组VEGF浓度依次为14.39±0.62 pg/m L、12.21±0.87 pg/m L,这两组均与Ctrl组有显著性差异;c)At-EE能够明显抑制内皮细胞HUVEC的迁移,当加入外源性的IL-6或者VEGF时,这种抑制作用被阻断,说明了SKOV3分泌的IL-6和VEGF是At-EE抑制HUVEC细胞的迁移能力的关键分子。体外血管生成能力的实验也得到了同样的结果。5.WB分析At-EE处理SKOV3细胞中P-STAT3和NF-κB的表达会下调;利用Stattic、PDTC两种抑制剂WB实验验证了NF-κB、p-STAT3存在着相互调节关系,并利用抑制剂使NF-κB、p-STAT3下调后发现可以抑制SKOV3细胞中IL-6和VEGF表达;WB分析外源性IL-6和VEGF加入可以逆转At-EE下调SKOV3细胞中NF-κB、p-STAT3的表达。6.WB实验分析结果表明At-EE能够显著上调GRP78和CHOP两种蛋白的表达水平,且呈现浓度依赖性,这是At-EE诱导内质网应激的直接证据;WB分析沉默SKOV3细胞CHOP基因后可以逆转At-EE对NF-κB/p-STAT3的下调;ELISA实验显示沉默SKOV3细胞CHOP基因后可以逆转At-EE对IL-6/VEGF的下调;免疫组织化学染色实验证实At-EE能够下调NF-κB、p-STAT3、VEGF、IL-6,上调CHOP的表达。结论:通过体内外实验证实At-EE具有抗卵巢癌的活性,这一活性与抗肿瘤血管生成有关。At-EE不会直接影响正常血管内皮细胞,但可以通过抑制p-STAT3和NF-κB的激活来下调卵巢癌细胞分泌IL-6和VEGF,导致肿瘤血管生成被抑制。此外,我们证明了p-STAT3和NF-κB可以相互调节,IL-6和VEGF也可以介导p-STAT3和NF-κB的激活,这样形成一个循环。另外,实验也证实At-EE可以通过诱导内质网应激阻断p-STAT3/NF-κB/IL-6和VEGF环路。本实验研究为草果的抗卵巢癌作用奠定了一定基础,为从草果提取物中筛选与分离抗卵巢癌药物提供了可能的研究方向。