龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国南方重要的热带亚热带木本果树，其胚胎发育状况影响着果实的产量及品质。植物胚胎的发育是一个细胞分化的过程，该过程中必然存在众多调控因子的作用，而MicroRNA作为一类新型调控因子在植物胚胎的细胞分化和发育过程中起着重要的调控作用。植物体胚与活体胚胎在形态和分子水平上具有相似性，是研究植物胚胎发育的理想实验系统。本研究利用龙眼体胚转录组数据信息(NCBI: SRA050205)，在进行龙眼胚性愈伤组织若干miRNA初级体及微管蛋白基因克隆的基础上，进一步进行miRNA的功能分析（外源激素及非生物胁迫下miRNA和β-tubulin基因的定量表达分析、miRNA初级体的超表达研究及miRNA与靶基因的互作机制研究），以探讨龙眼体胚发生中miRNA作用的分子机制，并为龙眼活体胚胎发育中的miRNA作用机制提供参考。主要的研究结果如下：1龙眼胚性愈伤组织miR156a-1、miR156a-2、miR166a、miR397a初级体克隆及生物信息学分析利用RT-PCR技术，从龙眼胚性愈伤组织中获得了4条miRNA的初级体序列，分别命名为dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a，大小分别为254bp、751bp、560bp、228bp。生物信息学分析表明：dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a均含有miRNA典型的二级结构，并且它们二级结构自由能远远高于一般植物的平均自由能；系统发育树显示，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR397a与拟南芥同源性很高，dlo-pri-miR166a与甜橙有很高同源性；此外，利用psRNA Target程序预测出miR156a-1、miR156a-2、miR166a、miR397a靶基因。2龙眼胚性愈伤组织靶基因β-tubulin及laccase基因家族的克隆及生物信息学分析利用RT-PCR技术，并结合同源克隆的方法从龙眼胚性愈伤组织中获得了2条β-tubulin基因的ORF序列和1条laccase基因的部分序列，分别命名为dl-β-tubulin3（KC127682）、dl-β-tubulin6（KC921220）、dl-laccase，其中dl-laccase为部分序列，共有1166bp；dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6全长分别为1508bp和1504bp，含1350bp和1351bp的最大开放阅读框(ORF)，分别编码446个氨基酸。生物信息学表明，这两种蛋白的二级结构和三级结构相似，无跨膜结构，属于亲水、稳定的酸性蛋白，定位于细胞核。同源性分析，发现dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6基因编码蛋白与不同物种均有较高同源性。3外源激素及非生物胁迫下dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析本实验以miR156cf、miR2089、5.8S、EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，利用荧光定量PCR技术，分析外源激素及非生物胁迫处理样本中dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6表达变化规律（dlo-miR166a在整个外源激素及非生物胁迫处理过程中均未表达）。3.1外源激素胁迫下成熟dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析①不同浓度乙烯处理下dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析。Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6在外源乙烯胁迫处理样本中的表达规律： dlo-miR156a在整个胁迫处理过程中，其转录水平波动较大，在乙烯浓度为30（ppm）的这个点，其相对表达量达整个处理过程的最高值，在乙烯浓度为50（ppm）的这个点，dlo-miR156a的相对表达量达整个处理过程的最低值；dlo-miR397a在整个胁迫处理过程中，其表达主要呈先上升后下降，随后又略微上升的规律。在乙烯浓度为30（ppm）的这个点，其相对表达量呈现峰值；在乙烯浓度为50（ppm）的这个点，dlo-miR397a的相对表达量最低；dl-β-tubulin3基因在乙烯胁迫处理过程中，表达主要呈上升趋势，在乙烯浓度为100（ppm）的点，表达呈现峰值；dl-β-tubulin6基因在乙烯胁迫处理过程中，表达主要呈现先大幅度下降后小幅度上升和下降的规律，并在乙烯浓度为30（ppm）的点，相对表达量达最低。②不同浓度赤霉素(GA3)处理下dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析。Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6在外源赤霉素胁迫处理样本中的表达规律：dlo-miR156a在整个胁迫处理过程中，表达主要呈下降趋势，并在GA3浓度为6（mg/L）的这个点，相对表达量达最低；dlo-miR397a在整个胁迫处理过程中，其表达主要呈现先上升后下降再上升的趋势，并在GA3浓度为10（mg/L）的这个点，相对表达量最低。此外，dlo-miR397a在GA3浓度为25（mg/L）的这个点，相对表达量呈现峰值；dl-β-tubulin3基因在赤霉素胁迫处理过程中，其转录水平波动较大，在GA3浓度为3（mg/L）与10（mg/L）的点，相对表达量均呈现最低值。此外，dl-β-tubulin3在GA3浓度为6（mg/L）的这个点，相对表达量呈现峰值；dl-β-tubulin6基因在赤霉素胁迫处理过程中，其表达主要呈现先直线下降，而后又小幅上升下降的趋势，并在GA3浓度为25（mg/L）点，相对表达量几乎为零。③不同浓度吲哚乙酸（IAA）处理下dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析。Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6在外源吲哚乙酸胁迫处理样本中的表达规律：dlo-miR156a在不同浓度IAA处理样本中表达主要呈现先下降后上升的趋势，并在IAA浓度为0.5（mg/L）的这个点，相对表达量达最低，在IAA浓度为3（mg/L）的点相对表达达最高；dlo-miR397a在不同浓度IAA处理样本中表达主要呈现先上升后下降的趋势，并且上升下降转折点IAA的浓度为1（mg/L）；dl-β-tubulin3基因在吲哚乙酸胁迫处理过程中，其表达主要呈现先上升后下降的趋势，dl-β-tubulin3在IAA浓度为1（mg/L）的点相对表达量达最高，并在浓度为1.5（mg/L）的点相对表达量达最低；dl-β-tubulin6基因在吲哚乙酸胁迫处理过程中，其表达主要呈下降趋势，并在IAA浓度为0.5（mg/L）的点相对表达量达最低，随后表达趋势趋于稳定。④不同浓度的茉莉酸甲酯（MJ）处理下dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析。Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6在外源茉莉酸甲酯胁迫处理样本中的表达规律：dlo-miR156a在不同浓度MJ胁迫处理样本中，表达主要呈现先下降后上升再下降的趋势，并在MJ浓度为100（μmol/L）和150（μmol/L）的点，相对表达量分别呈现峰值和最低值；dlo-miR397a在不同浓度MJ胁迫处理样本中，表达主要呈上升趋势，并在MJ浓度为150（μmol/L）的点，相对表达量达最高；dl-β-tubulin3基因在胁迫处理过程中，其表达主要呈上升趋势，并在MJ浓度为150（μmol/L）的点相对表达量达最高；dl-β-tubulin6基因在MJ胁迫处理过程中，其转录水平波动较大，在MJ浓度为50（μmol/L）的点相对表达量最低，随后在MJ浓度为75（μmol/L）的点，相对表达量呈现峰值。⑤不同浓度的水杨酸（SA）处理下dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析。Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6在外源水杨酸胁迫处理样本中的表达规律：dlo-miR156a在不同浓度SA处理样本中的表达主要呈下降趋势，并在SA浓度100（μmol/L）点相对表达量达最低；dlo-miR397a在不同浓度SA处理样本中的表达主要呈先上升后下降，再大幅度上升的趋势，并在SA浓度为75（μmol/L）和100（μmol/L）的点，相对表达量分别呈现最低与最高；dl-β-tubulin3基因在不同浓度SA胁迫处理中，其表达主要呈先上升后下降的趋势，表达发生变化的点恰好是dl-β-tubulin3基因表达呈现峰值的点；dl-β-tubulin6基因在SA胁迫处理中，其表达主要呈先上升后下降的规律。Dl-β-tubulin6基因在SA浓度50（μmol/L）点相对表达量达最高，在SA浓度100（μmol/L）点相对表达量达最低。3.2非生物胁迫下成熟dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析利用荧光定量PCR技术，对经蔗糖胁迫处理的龙眼胚性愈伤组织Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6基因进行表达分析，结果如下：不同浓度的蔗糖处理下dlo-miR156a、dlo-miR397a及靶基因dl-β-tubulin荧光定量PCR表达分析。Dlo-miR156a、dlo-miR397a、dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6在蔗糖胁迫处理样本中表达规律：dlo-miR156a在不同浓度蔗糖处理样本中的表达主要呈先上升后下降的趋势。Dlo-miR156a在蔗糖浓度为30（g/L）的点，相对表达量最高，在蔗糖浓度为90（g/L）的点，相对表达量最低；dlo-miR397a在不同浓度蔗糖处理样本中，相对表达量整体呈上升趋势，并在蔗糖浓度为90（g/L）的点，相对表达量最高；dl-β-tubulin3基因在不同浓度蔗糖胁迫处理中，其表达主要呈先上升后下降的趋势。Dl-β-tubulin3在蔗糖浓度为30（g/L）的点，相对表达量最高，并在蔗糖浓度为90（g/L）的点，相对表达量最低；dl-β-tubulin6基因在不同浓度蔗糖胁迫处理中，其表达主要呈先上升后下降趋势，并在蔗糖浓度为30（g/L）的点，相对表达量最低，在蔗糖浓度为70（g/L）的点，相对表达量最高。4龙眼胚性愈伤组织dlo-miR156a-1、dlo-miR156a-2、dlo-miR166a、dlo-miR397a初级体超表达研究利用烟草叶片注射并结合GUS基因瞬时表达，进行dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a初级体的超表达研究。结果表明：成熟dlo-miR156a、 dlo-miR166a、 dlo-miR397a表达量均增加，并且对于不同长度dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2，成熟dlo-miR156a表达量也有很大差异。5龙眼胚性愈伤组织dlo-miR397a与靶基因dl-β-tubulin家族的互作机制研究根据dlo-miR397a与非主要靶标dl-β-tubulin3及关键靶标dl-β-tubulin6在植物活体共同表达的原理，利用烟草叶片注射法，进行dlo-miR397a与键靶标互作机制研究。结果表明：dlo-miR397a与关键靶标dl-β-tubulin6间存在负调控，同时这种调控也存在于非关键靶标dl-β-tubulin3。