肝脏疾病最终常常发生功能的紊乱和脏器的衰竭。肝移植为肝脏疾病的治疗提供了无限前景。但供体肝源不足、排斥反应及长期免疫抑制剂的治疗限制了肝移植的发展。肝干细胞移植成为一种有潜力的替代治疗方法。同时对肝干细胞增殖、分化的研究还有助于了解肝脏的发生、发育机制,为进一步研究肝癌的发病机制及治疗提供基础。近年来,随着分子生物学、细胞生物学、细胞培养技术及免疫学的发展,肝干细胞的分离鉴定和培养取得了一些进展。但如何分离、筛选获得高纯度、高特异性的肝干细胞,如何建立肝干细胞稳定的体外培养系统,如何调节肝干细胞特异分化,仍是急需解决的问题。在该课题的第一部分中,我们首先制备了含LoxP位点特异修饰的SV40大T抗原基因的SSR#69逆转录病毒液,并感染从孕14.5d的胎鼠肝脏中分离出的肝细胞(此时的肝细胞被认为大部分为肝前体细胞),使其永生化。再用有限稀释法培养获得单克隆永生化细胞株,并进一步筛选鉴定。首先取不同阶段的肝组织:孕12.5d、14.5d、16.5d、18.5d及出生后1d、7d、14d、28d,利用real time PCR观察常见的早期指标和晚期指标的表达趋势。结果发现其早期标志基因CD34、Pou5f1随组织的发育成熟逐渐降低;AFP早期逐渐上升,至出生前达到最高,出生后开始迅速降低;DLK早期逐渐上升,至16.5d达到最高,后逐渐降低。晚期标志基因Alb、CK18、TAT、ApoB随组织的发育成熟逐渐上升,TAT上升较晚,约出生后第二周开始。在此基础上我们以相同方法获得的出生后14d的永生化肝细胞株LC14d及肝肿瘤细胞株Hepa1-6为对照,筛选出高表达早期标志基因的单克隆细胞株5个,并进一步通过形态学观察、地塞米松和二甲亚枫诱导分化等进行鉴定。结果显示筛选获得的单克隆细胞株细胞增殖旺盛、成集落样生长,体积较小、多边形、核浆比例高。经诱导分化后,ICG摄取试验证实筛选出的单克隆细胞株可诱导分化为成熟的肝细胞,为具有分化潜能的肝前体细胞。连续传代50代后检测细胞无明显差异。第二步我们检测导入的外源基因SV40大T抗原是否可逆。首先我们用western blot检测证实获得的永生化肝前体细胞株有大T抗原的表达,说明SV40大T抗原的导入成功。而加入腺病毒Ad-Cre处理后,细胞无大T抗原的表达,说明在Cre重组酶的作用下,大T抗原可以被敲除。而经腺病毒Ad-Cre处理的单克隆细胞株生长曲线降低,白蛋白荧光素酶报告质粒检测显示白蛋白表达上升,即分化增加。也证实SV40大T抗原可促进细胞的增殖,抑制细胞的分化,而Cre重组酶可敲除LoxP位点特异修饰的SV40大T抗原基因。第三步体内成瘤实验。我们于皮下注入荧光素酶标记的永生化肝前体细胞株,对侧注入同样标记的经Cre重组酶处理的永生化肝前体细胞株,并以肝癌细胞株为对照,活组织成像随访。结果显示随着时间的延长,植入细胞荧光素酶的表达降低,说明皮下存活的细胞数减少。与肝癌细胞株相比,皮下植入永生化肝前体细胞株荧光素酶的表达在10天内基本消失,没有成瘤的趋势。而经Cre重组酶处理后的永生化肝前体细胞株,荧光素酶的表达消失提前,说明细胞增殖降低,存活时间缩短。这同样也说明导入的大T抗原可以被敲除,是可逆的。因此,在第一部分实验中,我们获得了可逆的永生化的肝前体细胞株,为我们第二部分的实验打下良好的基础。在该课题的第二部分中,我们检测了维甲酸(Retinoic acid,RA)对肝前体细胞分化的影响。维甲酸是维生素A的体内衍生物。和其它类视黄醇一样,它在脊椎动物的胚胎发育、内环境的稳定及细胞的增殖分化中都发挥着重要作用。但维甲酸在组织特异性前体细胞分化中的作用报道却很少。因此,本课题在第一部分构建永生化肝前体细胞株的前提下,进一步研究了维甲酸对胎肝前体细胞分化的影响,以期获得一种诱导肝前体细胞分化的新方法,并进一步研究维甲酸诱导肝前体细胞分化的机制。而维甲酸可诱导与肝脏具有共同起源的胰腺祖细胞的增殖和进一步分化为β细胞,也提示维甲酸可能在肝脏的发育中有重要作用。在该部分研究中我们首先检测了不同阶段的肝组织中内源性维甲酸合成代谢相关基因及维甲酸受体和辅助因子的表达水平。结果显示维甲酸受体RARα、RXRα和RXRγ在所有样品中均有表达;而RARβ和RXRβ在出生前表达较低而出生后逐渐升高;RARγ在出生前无表达,出生后逐渐上升。维甲酸合成酶Raldh1和Raldh2在所有组织中均有表达,Raldh3在出生前表达很低,出生后稳定表达。核受体共抑制剂在所有样品中均高表达,而共激动剂在出生前逐渐降低,出生后逐渐上升。提示维甲酸信号系统可能和肝前体细胞的分化密切相关。我们进一步利用白蛋白荧光素酶报告质粒筛选获得了全反式维甲酸和9-顺式维甲酸最适药物浓度,通过最适药物浓度的全反式维甲酸和9-顺式维甲酸诱导,RT-PCR检测可见其早期标志基因表达降低,晚期标志基因表达上升,免疫荧光检测得出一致的结论。糖原沉积试验结果显示诱导后糖原沉积增加。以上结果说明全反式维甲酸和9-顺式维甲酸能促进肝前体细胞向前肝细胞的分化。为进一步了解参与该途径的维甲酸受体,我们构建了腺病毒RARα和RXRα,感染细胞后通过白蛋白荧光素酶报告质粒检测其分化的改变。结果显示感染腺病毒RARα或RXRα后,肝前体细胞株HP14.5中白蛋白的表达无明显改变,说明全反式维甲酸和9-顺式维甲酸在参与调节肝前体细胞分化的过程中,可能并不是通过受体RARα或RXRα发挥作用。结论:成功分离和构建了可逆的永生化的肝前体细胞株;维甲酸能促进肝前体细胞的分化,但可能不是通过受体RARα或RXRα发挥作用。