柑橘是一种重要的木本作物，充分利用各种分子标记是柑橘育种的一个重要手段。本研究主要进行了两种标记在柑橘上的开发和利用。第一种是MSAP标记的开发和利用。MSAP(methylation-sensitive amplification polymorphism)是一种AFLP与DNA甲基化相结合的标记。DNA甲基化是DNA的一种重要修饰，在基因的表达调控中起了重要作用。通过愈伤组织再生是柑橘繁殖的一个重要途径，在现代生物技术上有着非常广泛的应用。然而调控柑橘愈伤组织再生的一些关键性因素尚未研究清楚，为这项技术的应用带来了诸多麻烦。本研究旨在利用MSAP标记筛选在愈伤组织再生过程中DNA甲基化的发生变化的位点，进而研究DNA甲基化在再生过程中的变化规律，希望以此为突破口，了解DNA甲基化在愈伤再生过程中的作用。第二种是微卫星标记的开发。微卫星标记是一种已在柑橘育种上广泛应用的标记，但目前可用的标记和种类都比较有限。在这个研究中，尝试利用生物信息学，直接从序列数据库中开发SSR标记，并获得了一定的成功。主要研究结果如下： 1 以伏令夏橙和山金柑为材料，分别建立了来源于同一胚状体的单胚系，并观测了愈伤再生过程的畸形状况。再生过程中畸形的主要有胚状体发育畸形，子叶畸形和叶型，节间距、株型不正常。胚状体在产生畸形植株的过程中，也能产生非畸形植株；畸形植株在随后的生长过程中还能恢复正常株型，具有一定的不均一性和可逆性。这和拟南芥上有关DNA甲基化导致的畸形有一定的相似性。 2 以来源于同一单胚系的愈伤、胚状体、叶片以及长期继代的愈伤为材料建立了一个山金柑MSAP试验体系。在PstI/MseI酶切组合中筛选了40对引物，发现了53个多态性位点。在14paII/EcoRI和MspI/EcoRI酶切组合中筛选了32对引物，一共发现了19个多态性位点。证明了这种方法可以用于再生过程中DNA甲基化分析。 3 这些多态性的带表现出三种类型，一是从愈伤到叶片，带逐渐消失；二是从愈伤到叶片，带逐渐出现；三是从愈伤到叶片，带先出现又消失。这个结果意味着在愈伤再生过程中，不同位点DNA甲基化变化规律不同，DNA甲基化水平可能升高，也可能降低，表现出位点特异性。总体上讲，DNA甲基化水平在新鲜愈伤中最低，继代和再生过程都会上升。部分位点经克隆后用作探针进行southern blotting杂交，证实了这些MSAP的带型。 4 对部分多态性带进行克隆和序列分析。19个多态性带克隆测序后，发现部分带可能来自多个位点。对这些序列进行Blast分析后，有18条序列发现了同源序列，