Purα与Egr-1对淀粉样前体蛋白(APP)转录调控作用的研究

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目的淀粉样前体蛋白(APP)是一种跨膜蛋白,它的异常代谢产物A-β在神经组织中的积累所形成的senile plaque是Alzheimer病的主要发病因素之一。前期的实验结果已经证实,Purα蛋白能下调APP基因的表达,而Egr-1蛋白则能上调APP基因的表达。然而Purα蛋白的五个功能区域在此调节过程中是如何发挥作用的,它的活性功能域究竟位于什么地方,目前仍然不是十分清楚。通过研究了解Purα缺失片段对APP启动子下调的作用效果来确定Purα蛋白的活性功能域以及其与Egr-1之间的相互作用,正是我们所研究的主旨所在。方法(1)根据Purα和Egr-1基因序列设计引物,构建pCDNA3-Purα缺失突变体、pCDNA3-Egr-1质粒、pGEX4T1-Purα缺失突变体和pGEX4T1-Egr-1质粒。(2)Luciferaseassay,将Purα缺失突变体和APP启动子共转染到U87细胞,通过对APP活性的分析,确定Purα对APP调控作用的功能区域。(3)Pull-down assay和Co-IP,确定Purα蛋白和Egr-1蛋白之间是有否直接的相互作用(physical interaction)。结果(1)重组质粒pCDNA3-Pur α缺失突变体和pCDNA3-Egr-1质粒以及pGEX4T1-Purα缺失突变体和pGEX4T1-Egr-1质粒经双酶切鉴定和测序后,证实克隆序列完全正确。(2)Luciferase assay证实Purα全长对APP基因表达下调作用最大,其他四个突变体对APP基因表达下调作用各不相同。(3)通过Pull-down assay和Co-IP实验,我们没有发现Purα蛋白和Egr-1蛋白之间有直接的相互作用(Physical interaction)。结论(1)Purα蛋白对APP基因表达的调控依赖于其结构的完整性,Purα结构越完整,对APP启动子下调作用的效果越明显,说明五个不同的蛋白结构域共同作用才能发挥对APP基因的最大的调控作用。(2)Purα蛋白和Egr-1蛋白没有直接的相互作用(Physical interaction),由于两种蛋白在APP基因启动子上的结合部位是重合的,两者有可能通过竞争性结合其在APP启动子的5’UTR区中的结合位点而发挥调控作用,这也肯定了我们以前所提出的两种蛋白之间存在有一种互相置换作用的假说(Displacement hypothesis)。
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