背景与目的肿瘤抗原的寻找一直是肿瘤免疫学研究中面临的重要课题。Sahin报告的SEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)方法是从体液免疫的角度寻找肿瘤抗原，为寻找肿瘤抗原提供了一种全新的途径。该方法已经用于多种类型的肿瘤抗原的筛选及鉴定，并发现了一些新的肿瘤相关抗原，显示出良好的应用前景。肺癌是全球最普遍的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均占各种恶性肿瘤之首，从确诊到死亡，其五年存活率不到15％，如此高的死亡率主要原因是肺癌难以早发现、早治疗，且预后差。目前肺癌早期诊断的方法有限，因此寻找新的更具优势的肿瘤相关抗原用于肺癌的早期诊断是急需研究的课题。用SEREX法筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原的研究在国内外较少。本研究以肺癌患者的血清筛选肺癌组织cDNA表达文库，鉴定出肺癌表达的肿瘤抗原，并对其中的部分候选抗原做进一步的血清IgG抗体检测反应分析，期望为肺癌的早期诊断和预后提供新的标记物，为肺癌疫苗的研制及免疫效果监测打下基础，并且为探讨肺癌发生、发展的分子机理提供依据。方法一、肺癌相关抗原的异体血清筛选1．将肺癌cDNA表达文库铺板，转膜，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，3％脱脂奶粉封闭，同1∶100稀释的预吸收血清反应后，与1∶5000稀释的二抗反应，在二氨联苯胺(DAB)的作用下显色，抗原抗体复合物处呈现紫蓝色。重复铺板和筛选3次，直到获得阳性重组噬菌体。2．挑取阳性噬菌斑，噬菌斑块于SM缓冲液中4℃保存。阳性克隆经过体内剪切，成为pBluescript SK-噬菌粒。3．提取质粒，XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切初步鉴定插入片段的大小。4．质粒以T3、T7通用引物测序，序列结果用BLAST软件搜索Genbank，进行同源性比对分析。二、筛选出的肺癌抗原的初步血清反应分析1．将第三轮筛选获得的阳性重组噬菌体铺板，转膜，IPTG诱导蛋白质表达，3％脱脂奶粉封闭，分剪成大小为1cm×2cm的100份，分别与50例肺癌患者、50例正常人预吸收血清反应后，与1∶5000稀释的二抗反应，在二氨联苯胺(DAB)的作用下显色，抗原抗体复合物处呈现紫蓝色。2．统计学处理：比较每个克隆在肺癌病例和正常血清的阳性率，肺癌病例的阳性率高于正常血清的是阳性反应克隆。将筛选到的阳性反应克隆进行联合检测，测定其灵敏度和特异度。所有数据采用SPSS11.0软件包处理，统计学分析采用x~2检验、四格表的确切概率法。结果1．经过三轮筛选，从5×10~5pfu／ml的文库筛得70个阳性克隆，其插入片段大小为300bp～2800bp不等，平均长度为1.1kb。它们代表63个不同的基因，包括26个功能未知的基因，2个可能的新基因，35个功能已知的基因。在已知功能的基因中，有1个基因与肺癌的发生、发展关系密切；34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系，与其它肿瘤的发生、发展有关。2．在35个功能已知的基因中选择5个肺癌候选抗原基因，用50例肺癌患者和50例正常人血清对它们介导的IgG免疫反应进行检测、分析，得到3个阳性反应的肺癌相关抗原克隆。3．把这3个阳性反应抗原克隆联合起来分析，发现同时进行检测时能够在保持特异度等基本不变的前提下，明显提高诊断的灵敏度，具有较大的临床诊断价值。结论本研究鉴定出的肺癌相关抗原及进一步的血清学分析，有助于进一步阐述肺癌的发生机制，为肺癌的早期诊断、联合检测及免疫治疗提供候选标志物，也为肺癌的早期诊断提供了一个新的方向。