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非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，病死率接近100%。自2018年8月确诊第一例ASF以来，我国已经捕杀或活埋一百多万头猪，使国家养猪业蒙受严重损失。目前，ASF尚无有效的治疗手段和疫苗，因此快速准确的检测诊断是疾病防控的重要环节之一。基于ASFV核酸的RT-PCR检测目前已广泛用于ASF检测，但该方法需要特殊的仪器平台及对操作者较高的操作技术要求，限制了其在现场检测的应用。因此一种简便、快速、灵敏的ASFV现场检测技术对ASF防控至关重要。近年来，Cas新亚型的发现使得CRISPR/Cas技术在现场快速检测领域展现了强大应用潜力。本文利用CRISPR/Cas12的特异性酶切活性以及“附带切割”活性，构建基于Cas12的现场快速核酸检测平台，并基于此开发ASFV核酸现场快速检测技术。
本研究通过ASFV不同亚型的基因组序列比对分析，确定其特征性保守序列，设计CRISPR/Cas12特异性检测靶点；体外转录合成特异性crRNA-ASFV，结合重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase-aidedamplification，RAA)技术，构建Cas12介导的ASF快速检测荧光报告系统及试纸条报告系统，并进行系统特异性及灵敏性评估。结果显示，Cas12介导的ASF快速检测荧光报告系统的检测灵敏度可达10aM(10-17M)，相应的试纸条报告系统(Cas12-basedOn-siteand RapidDetectionSystem,CORDS)的检测灵敏度可达10-15M，其灵敏度已达到世界一流研究团队的水平，且均可在1h左右完成检测；同时试纸条检测系统与其他13种常见的猪病病毒核酸无明显交叉反应，具有高度特异性。对检测体系的各组分进行冻干有效性、加速稳定性测试发现其满足目前工业应用要求。
因此，CRISPR/Cas12介导ASFV快速现场检测系统，其操作简便性大大提高。尤其是试纸条系统，不需要特殊实验仪器和复杂专业的操作技能，在1h左右即可通过肉眼观察实验结果，为ASF的现场快速检测试剂盒的开发提供了较好的实验室方法学基础。同时该平台也有助于其他病原微生物及疾病相关分子检测方法的开发。
本研究通过ASFV不同亚型的基因组序列比对分析，确定其特征性保守序列，设计CRISPR/Cas12特异性检测靶点；体外转录合成特异性crRNA-ASFV，结合重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase-aidedamplification，RAA)技术，构建Cas12介导的ASF快速检测荧光报告系统及试纸条报告系统，并进行系统特异性及灵敏性评估。结果显示，Cas12介导的ASF快速检测荧光报告系统的检测灵敏度可达10aM(10-17M)，相应的试纸条报告系统(Cas12-basedOn-siteand RapidDetectionSystem,CORDS)的检测灵敏度可达10-15M，其灵敏度已达到世界一流研究团队的水平，且均可在1h左右完成检测；同时试纸条检测系统与其他13种常见的猪病病毒核酸无明显交叉反应，具有高度特异性。对检测体系的各组分进行冻干有效性、加速稳定性测试发现其满足目前工业应用要求。
因此，CRISPR/Cas12介导ASFV快速现场检测系统，其操作简便性大大提高。尤其是试纸条系统，不需要特殊实验仪器和复杂专业的操作技能，在1h左右即可通过肉眼观察实验结果，为ASF的现场快速检测试剂盒的开发提供了较好的实验室方法学基础。同时该平台也有助于其他病原微生物及疾病相关分子检测方法的开发。