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研究背景生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)是目前能在无生命条件下生长的最小原核细胞型微生物,可引起急慢性尿道炎、阴道炎、子宫内膜炎、盆腔炎、输卵管性不孕等多种疾病,并且作为AIDS相关支原体与患者的死亡密切相关。因此,开展对Mg的致病机制研究有利于提高对Mg相关疾病的认识和治疗。：到目前为止,与其它致病菌相比,在支原体中至今未发现类似于毒素、侵袭素、溶细胞素等典型的毒力因子,这主要是由于支原体基因组小,仅进化有维持基本生命功能的遗传物质。因此,支原体可能通过内源性结构及其代谢产物作为毒性效应器从而发挥其致病作用。近年研究表明,支原体的致病性与其碳代谢密切相关,并且不同的支原体利用的碳源有所不同。越来越多的研究表明,许多微生物拥有一套完整的甘油利用系统,甘油可能涉及到其多种病理生理及致病过程。因此本课题拟选取Mg甘油代谢的两个主要活性酶GlpK和GlpO,研究其定位和酶活性以及参与Mg细胞毒性中的作用。研究目的纯化出GlpK蛋白和抗GST-GlpK抗体,检测GlpK酶活性和GlpK参与Mg细胞毒性中的作用；纯化出GlpO蛋白和抗GST-GlpO抗体,检测GlpO定位与酶活性和GlpO参与Mg细胞毒性中的作用。研究方法1、Mg GlpK的甘油激酶活性构建原核表达载体pGEX6p-1/GlpK,诱导表达GST-GlpK融合蛋白,纯化后免疫BALB/c、鼠取抗血清,进行鉴定和抗体效价测定,纯化pAb；纯化出GlpK蛋白,检测其酶活性及温度和pH的影响。2、Mg Glp0的细胞定位及3-磷酸甘油氧化酶活性构建了原核表达载体pGEX6p-1/GlpO,诱导表达GlpO-GST融合蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠取抗血清,进行鉴定和抗体效价测定,纯化pAb；纯化出GlpO蛋白,检测其酶活性及温度和pH的影响；分离Mg膜蛋白和胞浆蛋白,分析GlpO蛋白的细胞定位。3、GlpK和GlpO对细胞毒性的调控作用电转化构建、筛选和鉴定GlpK和GlpO功能缺陷株；湿重法绘制Mg的碳源生长曲线；Western blotting检测碳源对GlpK或GlpO表达的影响；结合抗体抑制实验检测甘油代谢下Mg产生H2O2的量,观察HeLa细胞的毒性变化和HeLa细胞内的氧化应激状态。研究结果1、PCR扩增出1524bp目的片段,双酶切和测序证实成功构建出pGEX6p-1/GlpK重组质粒,成功表达了83kDa的可溶性目的蛋白,纯化目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得pAb,效价可达1：16000；GST-GlpK融合蛋白经酶切后,纯化出57kDa的GlpK靶蛋白,测定其甘油激酶活性为1.73U/mL,且随温度和pH值升高而升高。2、PCR扩增出1152bp目的片段,双酶切及测序证实成功构建出pGEX6p-1/GlpO重组质粒,成功表达出68kDa的可溶性目的蛋白,纯化后目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得pAb,其效价为1：32000; GST-GlpO融合蛋白经酶切后纯化出42kDa的GlpO靶蛋白,测定其3-磷酸甘油氧化酶活性为4.26U/mL,40℃和pH7时活性最高；G1pO蛋白在Mg胞膜和胞浆中均表达,但大部分位于胞浆中3、电转化后未筛选出GlpK和GlpO突发株；在葡萄糖下Mg生长迅速,在未加碳源或甘油下生长缓慢；甘油组和抗GST-GlpK抗体组Mg产生的H2O2明显高于未加甘油组和抗GST-GlpO抗体组；甘油组和抗GST-GlpK抗体组的HeLa细胞存活率明显低于未加甘油组和抗GST-GlpO抗体组：甘油组的HeLa细胞胞内检测出大量的H202和ROS,未加甘油组和抗GST-GlpO抗体组未检测出。结论1、成功构建出pGEX6p-1/GlpK和pGEX6p-1/GlpO重组质粒,并成功表达出GST-GlpK和GST-GlpO重组蛋白。2、GlpK具有甘油激酶活性；GlpO为跨膜蛋白,具有3-磷酸甘油氧化酶活性。3、甘油代谢下GlpO参与到Mg对宿主细胞的细胞毒性作用。