骨肉瘤是一种最常见的恶性原发骨肿瘤，其起源于分泌类骨质及骨基质的间质细胞，尽管在临床上骨肉瘤发病率相对较低，仅占全部肿瘤发病率10%以下，但是骨肉瘤发病人群主要以青少年和青年人为主，骨肉瘤的临床特点为恶性程度高，死亡率高，五年存活率低，因此骨肉瘤带给人们巨大生理及心理负担。骨肉瘤的治疗方面，通过采用高剂量化疗药物控制局部肿瘤生长的新辅助化疗已经显著改善骨肉瘤的预后，五年生存率获得提高。但是只有更好的了解肿瘤生长及重建方面的分子生物学的机制，才能进一步提高骨肉瘤治疗效果。因此新型基因靶向治疗方法是实现骨肉瘤肿瘤个体化治疗的重要手段。中介体复合物（Mediator）是RNA聚合酶II转录机制的基本组成部分，在哺乳动物和酵母菌中具有高度保守性，在诱导基础转录和调控真核细胞mRNA合成过程中具有重要作用。中介体复合物呈新月形，由头、体、尾等亚结构组成，中介体结构的组成与其生物遗传与生物化学功能具有一致性，头部复合结构直接与RNA聚合酶II相作用，是RNA聚合酶II转录过程中的基本结构，体部复合结构通过羧基末端与RNA聚合酶II相连，尾部复合结构通过识别和绑定活化因子在中介体共激活过程中有至关重要作用，Med19参与中介体复合物头部结构的构成。基因表达芯片研究中Med19基因的缺失和部分缺失可以提高或者抑制大部分的基因表达，Med19基因突变可以造成Gal4和Gcn4基因调控转录过程缺陷。另外一方面突变的Med19基因可导致热休克的抑制，葡萄糖抑制效应和HO基因阻遏作用的消失。研究结果表明Med19在调控细胞增殖和细胞周期中具有重要作用。细胞周期进程的反常是肿瘤发生的标志，目前人们对Med19在预防和治疗肿瘤等细胞增殖性疾病的认识有待进一步深入，Med19基因可能是肿瘤靶向治疗的候选基因之一。RNA干扰（RNAi）是一种内在基因沉默机制，这种基因沉默是一种有效的转录后水平基因沉默（post-transcriptional gene silence, PTGS），这种机制已经成为研究基因功能、癌症和病毒性疾病的有效工具。在本次研究中我们利用RNA干涉技术抑制Med19基因在人骨肉瘤细胞SaOS-2和U2OS中的表达，研究Med19基因敲低在细胞增殖和细胞周期进程中的作用。1材料和方法1.1细胞株SaOS-2和U2OS人骨肉瘤细胞株，来自ATCC美国标准生物品收藏中心。1.2细胞培养人骨肉瘤细胞株SaOS-2和U2OS培养于DMEM培养基，培养基中加入10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100ug/ml链霉素，37°C，5%CO₂1.3慢病毒载体设计和克隆Med19的cDNA序列根据于GenBank公布NM₁53450序列确定。pLVTHM慢病毒载体具有EF1-alpha启动子调控的GFP受体，慢病毒载体被限制性核酸内切酶酶切后线性化与插入片段相连接，所有插入序列经过DNA测序确定。1.4骨肉瘤细胞Saos-2和U2OS细胞内的慢病毒包装和转导为了产生转染的慢病毒颗粒，将病毒包装颗粒(（psPAX2and pMD2.G）和shRNA表达质粒使用Lipofectamine2000共转染至人胚肾细胞293T。两天后收集培养基使用0.45μm滤筛（Millipore, Bedford, MA）过滤，进行离心后浓缩。SaOS-2和U2OS按照浓度4×104cells/ml密度被接种于在6孔板，以shRNA慢病毒载体MOI1.0进行转染，5天后使用荧光显微镜（CKX41, Olympus）进行GFP表达观察。1.5定量RT-PCR测定Med19mRNA表达水平使用Trizol试剂提取法根据厂方说明提取各组细胞总RNA，使用M-MLV逆转录酶和oligo-dT引物经逆转录过程获得cDNA，RT-PCR（qPCR）通过TAKARATP800-Thermal Cycler DiceTM系统完成。20ul的PCR混合物包括SYBR green Master的混合物、配对的引物和模板。Med19相对表达水平数值分析采用2-△△Ct分析法。1.6Western blot测定Med19基因蛋白表达情况骨肉瘤细胞加入50ul Lysis buffer（2%硫基乙醇、20%甘油、4%SDS溶于100MmTris-HCL缓冲液，PH6.8）冰上裂解15分钟，高速离心破碎细胞、预冷裂解物，使用BCA Protein assay测定蛋白浓度。每份裂解产物（30ug蛋白）上样于12%SDS-PAGE。蛋白条带在电泳后使用电泳吸印仪转移至PVDF膜（Schleicher&Schuell Co，USA），5%脱脂牛奶TBST进行封闭后，与一抗在封闭液内4°C过夜。TBST洗膜3次后，与TBST（1:5000）稀释的二抗室温孵育2小时。被检测蛋白使用ECL+western bolttingsystem进行显色，GAPDH蛋白作为蛋白质表达的内参标准。1.7MTT法检测细胞活性使用MTT测试法检测细胞活性。将已转染或未转染的SaOS-2或U2OS （3×104cells/ml）接种于96孔培养板。此后5天，每24小时每批细胞被加入10ul MTT（5mg/ml），室温孵育4小时。移除培养液，每孔内加入100ul DMSO。摇荡培养板使用MTT甲臜室温下分解10分钟，使用全自动定量绘图酶标仪（Bio-Rad680）测定OD570m光谱吸收值。每组细胞重复实验3次。1.8细胞克隆形成测定细胞的生长和生存能力可以通过细胞集落（克隆）形成实验测定。对数生长期骨肉瘤细胞被胰蛋白酶消化制成单细胞悬浮液，接种于六孔板，密度为200cells/孔。细胞在37°C5%CO₂环境中培养14天，培养液每3天更换一次。然后细胞在室温下被4%多聚甲醛固定30分钟，细胞克隆被Giemsa染色15分钟，然后被洗涤和风干。细胞集落使用光学显微镜计数，实验重复进行3次。1.9流式细胞仪检测分析细胞周期收集转染培养7天的shRNA-Med19-Lv慢病毒载体转染的骨肉瘤细胞和阴性病毒对照组细胞及空白对照组细胞被胰蛋白酶消化后，使用预冷PBS洗涤细胞沉淀两次，70%冷乙醇将细胞团吹打均匀后4°C固定过夜，固定后预冷PBS洗涤两次，加入100μg/ml RNaseA和40μg PI避光调节下孵化30分钟。使用流式细胞仪（Becton-Dickinson,San Jose, CA）对细胞进行检测。细胞在G0/G1, S和G2/M周期分数使用专用数据软件（Becton-Dickinson, San Jose, CA）进行分析。实验重复三次。1.10Brdu法测定细胞增殖细胞周期S相的细胞使用Brdu细胞增殖测定分析方法进行分析，根据厂商说明进行操作。简言之，shRNA-Med19-Lv慢病毒转染组、阴性病毒对照组和空白对照组细胞以3×104cells/ml密度接种于96孔板度为培养2天和4天。然后，Brdu加入细胞中培养4小时。移出培养液后，细胞固定并且DNA变性。加入过氧化物酶抗Brdu标记并与细胞内Brdu结合，免疫复合物被四甲基联苯胺检测，检测OD490nm使用全自动定量绘图酶标仪（Bio-Rad680）检测光谱吸收度，吸收数值高低直接同DNA合成数量相关，因此确定细胞周期中处于S相细胞数目。1.11数据分析计量资料采用平均数±标准差（X±S）表示，两组间数值比较采用样本均数t检验，P<0.05表示差异有显著性统计学意义，P<0.01表示差异有极显著性统计学意义。2结果2.1转染效率为了测定在SaOS-2和U2OS骨肉瘤细胞内慢病毒的转染效率，转染5天后在MOI10标准下以光学显微镜测定GFP表达情况，在SaOS-2和U2OS细胞内慢病毒载体的表达效率几乎达到了90%。2.2在SaOS-2和U2OS细胞内Med19mRNA和蛋白表达的受到明显抑制shRNA-Med19-Lv载体转染的SaOS-2和U2OS细胞内Med19的mRNA和蛋白表达情况5天后使用RT-PCR和Western-blot分析测定。同阴性病毒对照组相比，shRNA-Med19-Lv组SaOS-2细胞内mRNA的含量明显下降达70%（**P<0.01）。此外在Western-blot实验中同阴性病毒对照组相比，shRNA-Med19-Lv组SaOS-2细胞内Med19基因蛋白表达也明显下降。阴性病毒对照组和空白细胞组内Med19mRNA和蛋白表达无明显差别。上述结果表明我们设计的shRNA-Med19可以明显抑制Med19基因在SaOS-2细胞内表达。2.3Med19基因沉默抑制SaOS-2和U2OS细胞的生长和增殖我们首先使用MTT测定Med19基因沉默对细胞增殖和细胞活力的影响。随着作用时间增加基因沉默对Med19基因的表达的抑制作用增强，SaOS-2和U2OS细胞活性降低。shRNA-Med19-Lv SaOS-2或U2OS组同阴性病毒对照组相比经过5天的转染后细胞数目分别下降61%和52%（**P<0.01）。细胞克隆形成测定结果shRNA-Med19-Lv组骨肉瘤细胞SaOS-2或U2OS细胞克隆数量的明显降低，分别降低大约分别为95.3%和96.8%,（**P<0.01），阴性病毒对照组细胞克隆数目未发生明显变化。所有结果表明shRNA-Med19-Lv造成Med19表达的降低可以明显抑制骨肉瘤SaOS-2和U2OS细胞的生长和增殖。2.4Med19基因沉默在G0/G1期明显抑制SaOS-2和U2OS细胞的生长和发育。为了更好的理解Med19基因沉默抑制细胞活性，我们使用流式细胞仪测定骨肉瘤细胞周期变化的情况， Med19基因沉默可以使SaOS-2细胞G0/G1期细胞比例明显增加（SaOS-2阴性病毒对照组54.32±0.76%增加到shRNA-Med19-Lv组72.48±1.46%）。在Med19-shRNA-Lv U2OS组细胞组我们可以观察到同样的结果。在阴性病毒对照组和空白细胞组G0/G1期和S期细胞数目没有明显差别。这些结果说明Med19基因沉默可以抑制SaOS-2和U2OS细胞增殖，并且骨肉瘤细胞停止分化停留在G0/G1期2.5Med19基因沉默减少S期细胞数目为了进一步证实Med19基因沉默对SaOS-2和U2OS细胞增殖影响，我们通过Brdu核素渗入法测定DNA合成比率，在细胞增殖DNA合成时Brdu代替DNA内的腺苷，因此测定含有Brdu的细胞数目可以反映全部S期细胞数目。shRNA-Med19-Lv组同阴性对照病毒转染组相比在转染2天之后SaOS-2细胞S期细胞比例没有明显变化，但在转染4天后S期细胞比例降低53%（**P<0.01）。在阴性对照病毒转染组同空白对照组相比S期细胞比例没有明显差别。Med19基因沉默可以明显的减少细胞周期中S期细胞数目比例，同样说明Med19基因沉默可以抑制骨肉瘤细胞恶性增殖。本实验成功构建能够稳定改变内源性Med19表达水平的慢病毒载体，慢病毒载体介导的shRNA可以有效的降低Med19基因在SaOS-2和U2OS细胞内的表达。Med19基因沉默诱导骨肉瘤SaOS-2和U2OS细胞停留在G0/G1期抑制其恶性增殖。Med19参与调控骨肉瘤细胞的恶性生物学行为，可作为骨肉瘤基因治疗候选靶基因之一，但是关于Med19基因调控人骨肉瘤细胞的细胞周期的机制，需要我们开展进一步研究完全揭示其功能和以及相应信号传导途径。