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背景与目的:鼻咽癌（NPC）的发病率在头颈部恶性肿瘤中高居榜首,其多为低分化鳞癌,发病极具地区特异性。研究证实,鼻咽癌是一种复杂多变的恶性疾病。遗传因素、Epstein-Barr病毒（EBV）感染以及环境暴露等因素都与其发生发展有密切关系。当前针对鼻咽癌较为有效的治疗手段是放、化疗。尽管近年来医学技术水平不断发展,新的放化疗方法与设备、药物层出不穷,但部分鼻咽癌患者治疗后仍出现复发、转移,其再次治疗效果差,预后不良。因此,进一步研究鼻咽癌的发生机制,寻找出一些新的、特异性的治疗途径挽救或延长这类患者的生命仍然具有非常重要的意义。胎盘特异蛋白8（Placenta-specific 8,PLAC8）,有研究者称之为onzin或C15,基因经转录翻译后包含112个氨基酸,是一种富含半胱氨酸的蛋白。研究发现在斑马鱼肠上皮细胞中PLAC8高表达;PLAC8促进了结肠癌细胞的上皮间质转化。还有研究发现PLAC8与细胞的增殖、凋亡、癌变、免疫和自噬有关。我们前期研究发现敲除PLAC8能够增加鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性。为了深入了解PLAC8与鼻咽癌恶性生物学行为之间的关系,我们探讨了PLAC8对人鼻咽癌细胞生长增殖、凋亡及EMT的影响,并明确了PLAC8调控鼻咽癌细胞生物学行为的分子机制。本研究分为三个部分:第一部分PLAC8在鼻咽癌细胞中的表达及其与EMT标志蛋白的关系研究目的:探究PLAC8在鼻咽癌组织标本及细胞中的表达及其与EMT标志蛋白表达的关系。研究方法:1.运用免疫组织化学染色法检测鼻咽癌肿瘤组织及对照的鼻咽炎组织中PLAC8的表达差异。2.运用免疫印迹（Western blot）检测永生化上皮细胞系NP69及鼻咽癌细胞系C666-1、CNE-1、CNE-2、5-8F、6-10B中PLAC8蛋白表达差异。3.运用免疫荧光组织染色法检测鼻咽癌肿瘤组织及鼻咽炎对照组织中PLAC8与EMT相关标志蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表达的关系。结果:1.免疫组化发现:与鼻咽炎组织相比,鼻咽癌肿瘤组织中PLAC8表达明显升高（P<0.01）。2.免疫印迹发现:PLAC8在NP69细胞中明显低表达,在鼻咽癌细胞中明显高表达。3.免疫荧光发现:与鼻咽炎组织相反,在鼻咽癌组织中,PLAC8表达升高,E-Cadherin下降,而N-Cadherin和Vimentin升高,初步提示PLAC8表达后可能增加了鼻咽癌细胞侵袭转移能力。结论:PLAC8表达在鼻咽癌细胞中显著升高,可能是鼻咽癌发生发展的促进因素。PLAC8与鼻咽癌EMT标志蛋白表达密切相关,其可能是影响鼻咽癌细胞侵袭转移能力的重要因素。第二部分PLAC8对鼻咽癌细胞生物学行为的影响及分子机制研究目的:探究PLAC8表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响及分子机制。研究方法:1.利用CRISPR/CAS9基因编辑技术构建PLAC8基因敲除的鼻咽癌细胞;以慢病毒LV-PLAC8感染并构建稳定过表达PLAC8的鼻咽癌细胞。2.利用CCK-8实验检测PLAC8对鼻咽癌细胞体外生长增殖的影响。3.利用裸鼠移植瘤模型检测PLAC8对鼻咽癌细胞体内生长增殖的影响。4.利用划痕实验检测PLAC8对鼻咽癌细胞体外迁移能力的影响。5.利用transwell实验检测PLAC8对鼻咽癌细胞体外侵袭、转移能力的影响。6.利用免疫荧光细胞染色和免疫印迹技术检测体内及体外PLAC8表达与鼻咽癌细胞的EMT标志蛋白E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin表达的关系。7.利用免疫印迹验证PLAC8是否通过TGF-β/SMAD信号通路来实现对鼻咽癌生物学行为的调控。结果:1.成功构建了敲除PLAC8基因的鼻咽癌细胞（ko PLAC8 CNE-2细胞）以及稳定过表达PLAC8的鼻咽癌细胞（oe PLAC8 CNE-2细胞）。2.与control组比较,ko PLAC8 CNE-2细胞的增殖能力显著下降（P<0.05）,oe PLAC8 CNE-2细胞的增殖能力显著增加（P<0.05）。3.与control组裸鼠瘤体体积比较,ko PLAC8CNE-2细胞组裸鼠体积显著减小（P<0.05）。4.与control组比较,ko PLAC8 CNE-2细胞的迁移距离显著缩短（P<0.05）,oe PLAC8 CNE-2细胞的迁移距离显著增加（P<0.05）。5.与control组细胞比较,ko PLAC8 CNE-2细胞穿膜细胞数量显著减少（P<0.05）,oe PLAC8 CNE-2细胞穿膜细胞数量显著增加（P<0.05）。6.与control组比较,ko PLAC8 CNE-2细胞E-Cadherin表达升高,N-Cadherin表达下降,Vimentin表达下降,EMT能力减小;oe PLAC8 CNE-2细胞E-Cadherin表达下降,N-Cadherin表达升高,Vimentin表达升高,EMT能力增加。7.与control组比较,ko PLAC8 CNE-2细胞的TGF-β1表达下降,Smad2磷酸化水平下降,Smad3磷酸化水平下降;oe PLAC8 CNE-2细胞则相反:TGF-β1表达升高,Smad2磷酸化水平升高,Smad3磷酸化水平升高。结论:PLAC8能够通过促进鼻咽癌细胞生长、增殖、侵袭、转移从而影响鼻咽癌细胞的恶性生物学行为;该作用与调控TGF-β/SMAD信号通路活性有关。第三部分PLAC8通过调控细胞自噬影响鼻咽癌细胞生物学行为的作用与机制研究目的:探究PLAC8通过调控细胞自噬来影响鼻咽癌细胞生长增殖、凋亡及EMT进程。研究方法:1.运用透射电镜观察敲除PLAC8后CNE-2细胞自噬情况。2.运用自噬双荧光体系检测敲除PLAC8后CNE-2细胞自噬潮现象。3.运用免疫印迹实验观察敲除PLAC8后CNE-2细胞自噬相关蛋白的变化。4.运用免疫荧光、免疫组化检测CNE-2细胞裸鼠移植瘤瘤体中自噬相关蛋白变化。5.运用CCK8法检测使用3-MA（自噬抑制剂）后能否逆转CNE-2细胞PLAC8敲除后的增殖抑制现象。6.运用克隆形成实验观察使用3-MA后能否逆转CNE-2细胞PLAC8敲除后的集落形成能力受抑制现象。7.运用流式细胞凋亡检测术观察使用3-MA后能否逆转CNE-2细胞PLAC8敲除后的细胞凋亡率上升现象。8.运用CCK8法检测敲低自噬相关靶基因Beclin1后能否逆转CNE-2细胞PLAC8敲除后的增殖抑制现象。9.运用克隆形成实验观察敲低Beclin1后能否逆转CNE-2细胞PLAC8敲除后的集落形成能力受抑制现象。10.运用流式细胞凋亡检测术观察敲低Beclin1后能否逆转CNE-2细胞PLAC8敲除后的细胞凋亡率上升现象。11.运用transwell实验观察抑制自噬后能否逆转敲除PLAC8后CNE-2细胞迁移、转移能力变化。12.利用免疫印迹检测抑制自噬后能否逆转敲除PLAC8后CNE-2细胞自噬相关蛋白及EMT标志蛋白E-cadherin和Vimentin表达的变化。13.运用自噬双荧光体系动态检测自噬抑制剂处理ko PLAC8 CNE-2细胞后细胞的自噬潮变化。14.利用免疫印迹检测ko PLAC8 CNE-2细胞中AKT/mTOR（介导自噬）信号通路活性的变化。15.利用免疫荧光双标染色定位PLAC8与AKT的位置。16.利用免疫共沉淀验证PLAC8与AKT的关系。17.运用免疫荧光、免疫组化检测影响CNE-2细胞裸鼠移植瘤瘤体中AKT/mTOR通路蛋白表达。结果:1.与control组CNE-2细胞比较,ko PLAC8组CNE-2细胞自噬体显著增加。2.与control组CNE-2细胞比较,ko PLAC8组CNE-2细胞自噬潮显著增加（P<0.05）。3.与control组CNE-2细胞比较,ko PLAC8组CNE-2细胞Beclin-1表达升高,LC3-II/LC3-I比值增大,P62表达下降（P<0.05）。4.免疫荧光和免疫组化实验发现,与control组比较,ko PLAC8组瘤体中Beclin-1蛋白表达升高,LC3-II蛋白表达升高,P62蛋白表达下降（P<0.05）。5.较ko PLAC8组CNE-2细胞,3-MA+ko PLAC8组的增殖能力提高了（P<0.05）。6.较ko PLAC8组CNE-2细胞,3-MA+ko PLAC8组的集落形成能力提高了（P<0.05）。7.较ko PLAC8组CNE-2细胞,3-MA+ko PLAC8组的凋亡率减少（P<0.05）。8.与ko PLAC8组CNE-2细胞比较,Si-Beclin1+ko PLAC8组CNE-2细胞增殖能力提高（P<0.05）。9.与ko PLAC8组CNE-2细胞比较,Si-Beclin1+ko PLAC8组CNE-2细胞集落形成能力提高（P<0.05）。10.与ko PLAC8组CNE-2细胞比较,Si-Beclin1+ko PLAC8组CNE-2细胞凋亡率显著减少（P<0.05）。11.抑制自噬后,敲除PLAC8的CNE-2细胞迁移（无基质胶）和转移能力（有基质胶）被逆转（P<0.05）。12.抑制自噬后,敲除PLAC8后的CNE-2细胞自噬相关蛋白及EMT标志蛋白的表达水平被逆转（P<0.05）。13.抑制细胞自噬后,与control组CNE-2细胞比较,ko PLAC8 CNE-2细胞自噬潮显著减少（P<0.05）。14.与control组细胞比较,ko PLAC8组细胞AKT磷酸化水平下降,mTOR磷酸化水平下降（P<0.05）。15.PLAC8与AKT在鼻咽癌细胞的细胞质中存在共定位。16.PLAC8与AKT能够互相结合。17.与control组比较,ko PLAC8组裸鼠瘤体中AKT磷酸化水平下降,mTOR磷酸化水平下降（P<0.05）。结论:鼻咽癌细胞中PLAC8通过AKT/mTOR信号通路调控细胞自噬。抑制细胞自噬可以逆转鼻咽癌细胞PLAC8敲除后的细胞增殖、集落形成能力、凋亡率及EMT变化。总之,本研究证实PLAC8可以通过促进TGF-β/SMAD信号通路来增加鼻咽癌细胞的恶性生物学行为;也可以通过促进AKT/mTOR信号通路来抑制鼻咽癌细胞自噬从而增加其恶性生物学行为能力。PLAC8未来有望成为鼻咽癌靶向治疗的一个有效靶点。