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目的：在成功体外分离培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的基础上，研究体外冲击波(ESW)干预对hMSCs增殖分化及成骨活性因子和酶联信号分子表达的影响，探讨ESW促进成骨过程中MAPK酶偶联信号通路的状态，为揭示ESWT治疗成骨障碍性疾病的机理提供理论依据。
方法：自早期成人股骨头坏死(ANFH)患者髂骨行骨髓穿刺抽取骨髓，采用密度梯度离心法提取hMSCs；经体外培养成功后，应用MTT法测定增殖活力，以确定ESW干预的合适剂量；施加ESW干预后，分别利用倒置相差显微镜、HE染色隔代(P1-P11)观察骨髓间充质干细胞形态、贴壁率和倍增时间等变化，应用酶细胞化学、免疫细胞化学等方法检测碱性磷酸酶含量、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-I)和转化生长因子-β1(TGFβ1)表达，以及磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK1/2)水平；使用PD98059阻断其上游激酶MEK，观察干预组pERK1/2及TGFβ1表达变化。对上述各部分实验数据采用相应的方差分析、配对t检验、X2检验和相关分析，设定P＜0.05为有统计学差异。
结果：1体外冲击波对骨髓间充质干细胞的影响显著：3kY即可以促进hMSCs的生长，5kV的ESW的促进增殖作用最强(P＜0.01)。高于7kY的ESW干预将抑制hMSCs贴壁、存活和增殖，生长峰值低于对照组。ESW干预体外培养hMSCs的最佳能量为5kV(100次)。
2原代hMSCs细胞呈圆或扁圆形，48h内陆续沉底贴壁，7～9d自细胞两极伸出足状的突起，呈短梭形或多角形，胞体透亮，折光性好；细胞多至瓶底的80％即可消化传代。
3传代细胞经HE染色，胞浆红染，核呈深蓝色，核仁明显。ESW干预后的P1代hMSCs增殖分裂加快，胞浆丰富，胞核较大，核仁2～3个；P3-P5代hMSCs核分裂相多，核浆比值大，增殖高峰提前，细胞簇集融合，呈放射状扩展；P7-P9代细胞体积增大明显，3～5d即呈条带状交错成片，基质堆积成束，方向性明显。干预后的P11代hMSCs仍有核分裂细胞呈对称分裂，表现出定向成骨分化的潜能；而对照组为不对称分裂和多种分裂方式，存在多向分化的可能。
4ESW干预后的P5代hMSCs贴壁率为61.54％，明显高于对照组(P＜0.05)；随后两组细胞的贴壁率差异逐渐加大。细胞倍增时间的变化与贴壁率并不同步：P3代干预组hMSCs提前进入对数生长期，倍增时间(Td)较对照组缩短1.72d；P5代干预组Td短于3d，细胞增殖能力最强；随后细胞成骨分化活跃，以胶原合成为主，核浆比骤减，P7代干预组Td短于延长至4.45d。与对照组相比，ESW干预明显缩短了hMSCs的倍增时间(P＜0.05)。
5对照组碱性磷酸酶(ALP)曲线近似呈S型，有明显的潜伏期(P0-P3)、指数生长期(P3-P7)和平顶期(P7之后)。ESW干预明显缩短了hMSCs生长潜伏期，1周后ALP含量即明显上升约14.2KU，增殖高峰提前在P5代出现(38.7KU)；干预组ALP总体水平明显高于对照组(P＜0.05)。
6ESW干预后的P3代hMSCs胞浆及胞核中出现大量黄色-棕黄色颗粒，IGF-Ⅰ阳性率为42.3％，而对照组无明显着色；P7代干预组细胞呈强阳性，阳性率达87.9％，对照组开始出现IGF-Ⅰ染色明显阳性的细胞，较干预组晚4代，约25d。两组间差异显著(P＜0.01)。骨髓间充质干细胞中TGF-β1出现较晚；ESW干预组P5代仅见个别细胞呈弱阳性表达，P7代hMSCs胞浆可见均匀、淡染黄色颗粒，P9代TGF-β1染色阳性率为72.2％，个别细胞浆内尚见深染的棕褐色颗粒；随后阳性率开始下降。对照组始终没有出现明显的阳性表达，两组间差异显著(P＜0.01)。TGF-β1阳性表达较IGF-Ⅰ晚6代，约40d，高峰持续时间短，仅在P9代干预组细胞。
7ESW干预后pERK1/2与TGF-β1的表达并不同步：P3代hMSCs胞浆内即出现黄染颗粒，pERK1/2弱阳性；对照组仅P9代个别hMSCs阳性(P＜0.01)。干预组P9代hMSCs中pERK1/2活跃，强阳性表达与TGF-β1高峰同代出现；经PD98059阻断其上游激酶MEK后，pERK1/2表达显著减弱(P＜0.01)，而TGF-β1染色仍呈均匀阳性(P＞0.05)。
结论：5kV(100次)的ESW是体外干预hMSCs试验的最佳能量；ESW干预能够提高hMSCs的贴壁、增殖及成骨活性，不同程度的促进了成骨活性因子的生成；ESW的骨科生物学作用可能是通过MAPK酶偶联信号通路实现的，TGF-β1在hMSCs增殖晚期参与了ESW对ERK激酶的激活；这一过程应该还有其它成骨活性因子或酶的参与。ESWT联合骨髓间充质干细胞移植将在临床治疗骨肌系统慢性损伤性疾病中发挥更为积极而广泛的作用。