目的:　　 观察木栓酮(Friedelin，FD)对人慢性髓系白血病(CML)细胞株K562增殖和细胞周期的影响和机制。　　 方法:　　 一、细胞培养　　 人慢性髓系白血病(CML)细胞株K562细胞用含15％胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养K562细胞，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱内，隔日换液，传代，取对数生长期细胞为实验对象。　　 二、四甲基固氮唑盐(3-(4，5-d i methyhh i azo l(—)2(—)y1)(—)2，5-d i phenyhetrazo lium bromide，MTT)法测定木栓酮对K562细胞增殖的影响　　 将K562细胞分为对照组和木栓酮组，木栓酮组包括10、20、50、100μmol/L组，培养24、48、72小时。采用四甲基固氮唑盐(3-(4，5-dimethyhhiazol-2-yl)-2,5-diphenyhetrazolium bromide,MTT)法测定木栓酮对K562细胞增殖的影响。　　 三、流式细胞仪检测木栓酮对K562细胞细胞周期的影响。　　 流式细胞仪测定K562细胞周期分布，细胞培养密度达1×106后，更换成无血清培养基培养12h，根据实验设计分别加入10、20、50、100μmol/L木栓酮，作用48h，收集细胞于离心管中处理，流式细胞仪检测，分析细胞周期。　　 四、实时定量RT-PCR检测细胞中CDK1 mRNA表达水平。　　 收集5×106细胞，按Trizol试剂盒说明书进行操作，所提取的RNA使用分光光度计定量并测纯度。分别对目的基因CDK1和管家基因GAPDH制作标准曲线。通过比较目的基因与管家基因M值差别来确定分析方法。同时制作熔解曲线，对定量PCR特异性扩增产物的熔解曲线的Tm值来分析其产物的特异性。　　 五、Western blotting蛋白印迹法检测细胞中CDK1蛋白表达水平。　　 分别将培养好的细胞株进行细胞计数，限定细胞数目在1～3×105/L范围内，分别提取各细胞株的总蛋白，定量后进行蛋白变性、上样、电泳、转膜，分别加入稀释度1∶1000的一抗4℃摇床过夜，分别加入二抗孵育2h，ECL试剂发光用凝胶成像系统扫描，记录条带与灰度值。　　 六、统计学处理　　 实验数据应用SPSS13.0统计软件分析，两个表达量的比较应用T检验，以P＜0.05为有显著性差异。　　 结果:　　 1、采用MTT法检测不同木栓酮浓度作用24h、48h、72h后，结果显示随着药物浓度和时间的延长，对K562细胞有明显的抑制效果。当木栓酮浓度大于50μmol/L作用时间超过48h，细胞的增殖活性明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其余组与对照组相比较其对细胞的增殖活性影响不明显(P＞0.05)。　　 2.用流式细胞仪测定K562细胞周期分布，使用10、20、50、100μmol/L木栓酮培养K562细胞48小时，结果显示，G0/G1期细胞的比例显著增多，同时S期比例减少，说明木栓酮可以抑制K562细胞由G1期向S期过渡，进而抑制细胞周期进程。　　 3.使用10、20、50、100μmol/L木栓酮培养K562细胞48小时，通过实时定量RT-PCR检测CDK1在不同浓度木栓酮作用下的K562细胞中的相对表达量，结果显示CDK1mRNA水平随木栓酮浓度的上升而下降，与对照组相比，木栓酮浓度为50-100μmol/L时CDK1mRNA下降有统计学意义(P＜0.05)，其余各组变化均无统计学意义(P＞0.05)。　　 4.使用western blot检测CDK1蛋白在不同浓度木栓酮作用下的K562细胞中的表达，结果显示木栓酮浓度为50-100μmol/L时CDK1蛋白表达量显著低于对照组CDK1蛋白表达量(P＜0.05)。　　 结论:　　 本实验说明木栓酮可以在体外抑制人慢性髓系白血病K562细胞增殖和细胞周期进程，其细胞内作用机制可能是通过CDK1蛋白的下调导致细胞周期进程阻滞，进而细胞增殖能力下降。