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目的:本研究首先通过在不同转染条件下,包括不同的转染溶剂、预处理和转染试剂浓度,对miR-21在神经元内表达水平和神经元损伤的检测,建立一种稳定、高效,并且对神经元损伤较小的转染方案。进一步通过转染体外神经元,并通过TBI模型来检测miR-21在TBI过程中是否发挥抗凋亡作用并探索其可能的作用机制,为进一步的研究和颅脑创伤的临床基因治疗提供理论依据方法:神经元取自24小时的Wistar乳鼠,培养7天。标记FAM的miR-21Agomior用于检测miR-21是否可以转染进入神经元。神经元随机分为5组:饥饿-DMEM(S-DMEM)组、非饥饿-DMEM(N-DMEM)组、饥饿-Neurobasal(S-Neurobasal)组和非饥饿-Neurobasal(N-Neurobasal)组和空白对照组(Sham)。miR-21 oligomers(20μM,2.5μl)与RNAiMAX(0.5/1/1.5/2/2.5μl)融合后,加入DMEM或Neurobasal-A使转染液达到500μl或250μl。饥饿组在转染前,仅加入250μlDMEM或Neurobasal行饥饿1小时。然后将转染液加入各组的到6孔板中转染6小时,继续培养48小时进行下一步的试验分析。mi R-21在神经元内的表达通过RT-PCR及miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表达情况来检测。同时为了避免miR-21的生物学作用对神经元损伤的影响,将miR-21 agomir更换为miR-21 negative control后,进行转染后,通过TUNEL凋亡试剂盒和MTT试验检测神经元损伤情况。按照上述转染方案,将FAM标记的miR-21 agomir用于检测miR-21的转染效率。然后将细胞随机分为5组:空白组,TBI组,TBI+miR-21agomir(TBI-A)组,TBI+miR-21 antagomir(TBI-AN)组和TBI+miR-21 negative control(TBI-NC)组。mi R-21 agomir,miR-21 antagomir和mi R-21 negative control按相应组进行转染;转染后48小时,除空白组外,分别进行划痕损伤。划痕损伤后24小时,各组神经元内miR-21和PTEN表示水平通过RT-PCT检测;各组神经元的凋亡情况通过TUNEL和MAP-2荧光双染检测。Western Blot检测PTEN、总AKT、p-AKT,以及其下游凋亡相关蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况。结果:FAM-miR-21可以转染进入神经元。miR-21在Neurobasal组中比DMEM组中表达明显升高,同时RANiMAX在1.5μl时,miR-21的表达水平达到最高峰,继续增加RANiMAX剂量没有增高miR-21的表达水平。同时神经元损伤具有条件依赖性和剂量依赖性,饥饿组凋亡细胞相对于非饥饿组明显增加,同时相对于RNAiMAX:miR-21=4/5:5,RNAiMAX:mi R-21=1/2/3:5的凋亡神经元明显减少。随后的试验证明,划痕损伤的神经元引起TBI中相似的凋亡情况,并且miR-21 agomir/antagomir可以上调/下调神经元中miR-21的表示水平。同时,TUNEL结果显示:miR-21减少TBI损伤中TUNEL阳性细胞。对PTEN-AKT通路检测发现:miR-21降低PTEN的基因表达水平和蛋白表达水平,并且使p-KAT表达水平升高。Western Blot检测凋亡相关蛋白结果显示:mi R-21减少caspase-9、cleavaged caspase-3和Bcl-2表达,而增加Bax在神经元中的表达。结论:miR-21转染神经元的方案是以Neurobasal-A为溶剂,不经过饥饿处理,在miR-21 agomir:RNAiMAX=3:5的比例下进行转染;同时通过上调或者下调神经元中miR-21表示水平发现,miR-21可以减少体外TBI模型中神经元的凋亡,同时研究发现,miR-21是通过作用于PTEN-AKT通路,调节下游相关凋亡蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表达水平来发挥作用的。